В каких случаях применяется фазово контрастная фотография. Фазовоконтрастная микроскопия. Интерпретация фазово-контрастных изображений

Информация о фазово-контрастном микроскопе

В программу обучения в средней школе биологии входят наблюдения клеток щеки. Для этого учащийся при помощи плоской зубочистки аккуратно соскребывает слой с внутренней поверхности щеки. Образец помещается на предметное стекло и накрывается крышкой. Клетки щеки – эпителиальные и рассматриваются в больших количествах. Если в образец добавить каплю йода, ядра клеток будут более заметны. Они будут выглядеть как небольшие круглые точки внутри клетки. Снимок слева демонстрирует, как выглядят клетки без йода под обычным микроскопом. На правом вы видите тот же образец при рассмотрении в фазово-контрастном микроскопе (на самом деле использовался тот же микроскоп, но под другим углом). Эти снимки наглядно демонстрируют значительное повышение качества изображения некоторых образцов при использовании фазово-контрастного микроскопа.

Что такое фазовый контраст?

Фазово-контрастным называется метод, разработанный в начале 20 века Фрицем Цернике (Frits Zernike). Цернике обнаружил, что, если ускорить прохождение света по прямой, можно вызвать деструктивную интерференцию модели в рассматриваемом изображении. Эти модели делают изображение более детальным, выделяя элементы на светлом фоне. Чтобы вызвать интерференцию моделей, Цернике разработал систему колец, расположенных как в линзе объектива, так и в конденсаторе. При правильной юстировке световые волны, испускаемые источником света, попадают в глаз со смещением по фазе на? длины волны. Изображение образца становится значительно лучше. Метод пригоден только для тех образцов, которые не поглощают свет (они называются "фазовыми объектами"), и отлично подходит для рассмотрения деталей некоторых образцов, таких как части клеток простейших, бактерий, жгутиков спермы и других клеток, не поглощающих свет. Этот метод оказался настолько прогрессивным для микроскопии, что Цернике была присуждена Нобелевская премия по физике 1953 года. Биографию Фрица Цернике можно найти .

Установка микроскопа для фазово-контрастных наблюдений.

Чтобы настроить микроскоп на наблюдений методом фазового контраста, Вам необходимы фазово-контрастные объективные линзы и фазово-контрастный конденсатор.

Не все фазово-контрастные микроскопы одинаковы, но, в основном, они используют аналогичные методы настройки системы для получения оптимальных результатов. В системе, показанной справа, фазовый конденсатор имеет пять положений (10x, 20x, 40x, 100x и BF) BF – "brightfield" – без фаз. Для настройки микроскопа с фазовой оптикой сначала установите его в положение BF и сфокусируйте на образце. Отрегулируйте высоту конденсатора для получения наилучшего изображения. Затем установите конденсатор в положение, соответствующее линзе, и уберите образец. Регуляторы с обеих сторон задней стенки конденсатора предназначены для его центрирования.

При микроскопии неокрашенных микроорганизмов, отличающихся от окружающей среды только по показателю преломления, изменения интенсивности света (амплитуды) не происходит, а изменяется только фаза прошедших световых волн. Поэтому глаз этих изменений заметить не может и наблюдаемые объекты выглядят малоконтрастными, прозрачными. Для наблюдения таких объектов используют фазово-контрастную микроскопию , основанную на превращении невидимых фазовых изменений, вносимых объектом, в амплитудные, различимые глазом.
Фазово-контрастное устройство может быть установлено на любом световом микроскопе и состоит из:
1) набора объективов со специальными фазовым пластинками;
2) конденсора с поворачивающимся диском. В нем установлены кольцевые диафрагмы, соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов;
3) вспомогательного микроскопа.

Настройка фазового контраста основном заключается в следующем: 1) заменяют объективы и конденсор микроскопа на фазовые (обозначенные буквой Ф или ph) ; 2) устанавливают объектив малого увеличения. Отверстие в диске конденсора должно быть без кольцевой диафрагмы (обозначенной цифрой «0»); 3) настраивают свет по Келеру; 4) выбирают фазовый объектив соответствующего увеличения и фокусируют его на препарат; 5) поворачивают диск конденсора и устанавливают соответствующую объективу кольцевую диафрагму; 6) вынимают из тубуса окуляр и вставляют на его место вспомогательный микроскоп. Настраивают его так, чтобы были резко видны фазовая пластинка (в виде темного кольца) и кольцевая диафрагма (в виде светлого кольца того же диаметра). С помощью регулировочных винтов на конденсоре совмещают эти кольца. Вынимают вспомогательный микроскоп и вновь устанавливают окуляр.

Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст). В РФ выпускают устройство КФ-4 для позитивного фазового контраста.
Фазово-контрастная микроскопия применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п. В этих случаях часто применяют биологические микроскопы с обратным расположением оптики - так называемые инвертированные микроскопы. У таких микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор - сверху. За изобретение фазово-контрастной микроскопии его автор голландский физик Цернике был удостоен Нобелевской премии.

Фазово-контрастный микроскоп значительно повышает контра­стность объектов, проницаемых для света, и в медицине ис­пользуется для изучения нативных препаратов. С помощью этого метода могут быть исследованы без предварительной обработки бесцветные, прозрачные объекты, детали, строение которых оп­тически мало различаются между собой.

Окрашенные препараты частично поглощают свет. Пучок света, проходящий через такой препарат, теряет в своей ин­тенсивности, т.е. уменьшается амплитуда световой волны, и это легко улавливается глазом исследователя. Такие препараты контрастны даже в обычном микроскопе и называются “амплитуд­ными”. Препараты, не поглощающие света, прозрачны. Пучок света, проходящий через такой препарат, не теряет своей ин­тенсивности. Амплитуда световой волны не изменяется, а лишь изменяется фаза колебания, что не регистрируется человече­ским глазом. Такие объекты называются фазовыми. К ним отно­сятся живые, неокрашенные препараты. Чтобы повысить контра­стность изображения, необходимо превратить фазовые изменения в амплитудные. Это достигается путем помещения в объективы фазовой пластинки в форме кольца и применением кольцевой диафрагмы. Каждому объективу соответствует своя диафрагма. Изображение этой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пла­стинки соответствующего объектива. Метод фазовых контрастов может быть положительным и отрицательным. В первом случае на светлом фоне поля наблюдается темное изображение объекта, а во втором фон темный, а объект светлый. Наилучшие результаты наблюдаются в случае положительного контраста.

Распространение световых волн в прозрачных однородных объектах не сопровождается потерей интенсивности света. Ме­няется только скорость прохождения светового потока через объект по сравнению со скоростью распространения света в окружающей среде. Она будет большей или меньшей в зависимости от того, будет ли показатель светопреломления объекта соответственно меньше или больше, чем в окружающей среде. Эти изменения, называе­мые иначе фазовыми, так как при них меняются только фаза ко­лебаний прошедшего света, характерны для большинства биоло­гических объектов (живых клеток, срезов тканей и т. п.).

Человеческий глаз хорошо определяет изменения интенсив­ности света, наступающие при прохождении через окрашенные (амплитудные) препараты, когда меняется амплитуда колебаний света. Однако глаз не способен воспринимать фазовые измене­ния света. Поэтому прозрачные неконтрастные (фазовые) объ­екты при обычном микроскопическом исследовании остаются не­видимыми.

Для работы по методу фазового контраста нужно, кроме обычного биологического микроскопа, иметь еще специальное устройство. Установку устройства производят следующим обра­зом. Конденсор и объектив заменяют фазовыми. Фазовый конден­сор поворотом револьверного диска устанавливают на 0. Это положение соответствует обычному светопольному конденсору. Затем, поместив на предметный столик препарат и сфокусировав его, приступают к наладке освещения. При исследовании мето­дом фазового контраста основным условием является оптималь­ная освещенность, которая достигается установкой света по Келеру. После этого устанавливают револьверный диск на то число, которое соответствует выбранному объективу; например, при объективе ´40 в окошечке также устанавливают цифру 40. Вынув окуляр, на его место устанавливают вспомогательный микроскоп и настраивают его на изображение двух колец (коль­цевая диафрагма конденсора и фазовая пластинка). Центро­вочным устройством конденсора добиваются совмещения колец. Заменив вспомогательный микроскоп окуляром, можно произво­дить исследование препарата.

Метод аноптрального контраста является усовершенствованием метода фазового контраста. Теоретические обоснования и конструктивные особенности аноптрального устройства, в основном не отличаются от обычной фазово-контрастной установки (рис. 6). Принцип его устройства заключается в следующем. На верхнюю поверхность предпоследней линзы иммерсионного объектива наносится кольцо из сажи, пропускающей лишь около 10% проходящего света. В передней фокальной плоскости кон­денсора помещается кольцевая диафрагма, изображение которой должно полностью совпадать с кольцом сажи на объективе. Пре­парат освещается полным конусом лучей, проходящих через кольцевую диафрагму конденсора. При отсутствии объектов (например, микробов в препарате) в объектив попадают только недифрагированные лучи, амплитуда которых, после того как они пройдут через кольцо сажи, уменьшится на 90%. В то же время амплитуда лучей, дифрагированных частицами объекта, которые пройдут мимо кольца из сажи, не изменится и поэтому фон поля будет темный, а частицы объекта светлыми. Пре­имуществом метода аноптральной микроскопии является боль­шая разрешающая способность объективов и возможность выяв­ления минимальных оптических разностей плотности в неокра­шенных препаратах. Чем больше оптическая плотность объекта, тем светлее его изображение. Методика использования устрой­ства не отличается от фазово-контрастного. При помощи аноптрального микроскопа можно изучать морфо­логию и локализацию нуклеоидов (ядерный аппарат), наблюдать за изменениями морфологии бактерий в процессе нормального роста и размножения.

Самым главным достоинством фазово-контрастного метода микроскопирования живых неокрашенных микроорганизмов является чёткое и контрастное их изображение. Данный способ изучения наиболее приемлем для исследований в клинических лабораториях для изучения различного рода выделений и осадков, простейших, их цист, процессов агглютинации, рассмотрение ретикулоцитов, а также кровяных пластинок, костного мозга качественных и злокачественных опухолей и прочее.

Для того чтоб понять сущность и принцип работы фазово-контрастного метода необходимо знать, что фотоплёнка и человеческий глаз способен воспринимать исключительно изменения амплитуды, то есть размахи колебаний световой волны, однако они не восприимчивы к изменениям её фазы, задержкам или ускорениям.

Все препараты, которые наблюдались в микроскопах в тех частях, где были смещения амплитуды световых волн, являются контрастными, а там, где присутствовали фазовые смещения, были малоконтрастные. Используя фазово-контрастные приспособления микроскопа, существующие фазовые неконтрастные колебания искусственно конвертируются в колебания с другой амплитудой, из-за чего фазовые элементы препарата становятся такими же контрастными, как и амплитудные. Вследствие этого изображение всего исследуемого объекта становится чётким и контрастным.

Для достижения подобного результата можно использовать обычный микроскоп МБИ – 2, а также специальный к нему набор фазово-контрастных приборов, в состав которых входят: конденсатор с комплектом кольцевых диафрагм, комплект фазовых объективов (10Х, 20 X, 40 X и 90Х), вспомогательный микроскоп малой степени увеличения, который используется вместо окуляра, осветитель и светофильтр.

Как правило, обычный конденсатор микроскопа заменяют фазовым и при этом необходимо проверить, чтоб этот конденсатор правильно и точно вошёл в держатель, и в процессе подъёма его передняя линза становилась вровень с предметным столиком микроскопа. Объективы также необходимо заменить на фазовые.

Для начала следует установить правильное освещение для объекта. Для этого осветительную лампу ставят на расстоянии пятнадцати-двадцати сантиметров от самого микроскопа, сужают диафрагму осветителя и направляют лучи на поверхность плоского зеркала, таким образом, чтоб точное и отчётливое изображение накаленной нити лампы оказалось в самом центре зеркала. Зеркало двигают, отбрасывая свет на поверхность диафрагмы конденсатора, которую затем полностью открывают.

Если увеличение слишком маленькое и его не достаточно, то в таких случаях устанавливают препарат для излучения. Опуская и поднимая конденсатор, выходит наиболее резкое изображение препарата при условии закрытой диафрагмы осветителя. Если же поле зрения всё-таки оказывается слишком освещённым, в таких случаях ставят дополнительный светофильтр. С помощью лёгких передвижений зеркал ярко освещённое пятно двигают в центр поля зрения и затем открывают диафрагму осветителя, таким образом, чтоб все поля зрения были полностью и равномерно освещены. На этом этапе заканчивается установка света.

Вместо окуляра устанавливают вспомогательный микроскоп. Ставят также тот фазовый объектив, который будут использовать и соответствующую ему кольцевую диафрагму конденсатора. При передвижении окулярной части вспомогательного микроскопа изучают изображение кольцевой щели диафрагмы конденсатора, то есть светлое кольцо, а также изображение фазовой пластинки в объективе – тёмное кольцо, для того, чтоб узнать, насколько совмещены эти два изображения.

Для того чтоб получить фазовый контраст нужно более полно совместить изображения этих двух колец. Данный процесс выполняется с помощью центрировочных винтов фазового конденсатора, благодаря которым щель конденсорной диафрагмы движется настолько, чтоб её изображение совместилось с изображением фазовой тёмной пластинки. Вспомогательный микроскоп достают из тубуса и устанавливают на его месте рабочий окуляр, после чего изучают необходимый объект.

Стоит также отметить основные условия успешного процесса подготовки фазово-контрастного исследования:

• Правильное расположение света;
• Полностью открытая диафрагма фазового конденсора;
• Полное соответствие номера кольцевой диафрагмы фазового конденсора относительно увеличению фазового объектива;
• Тщательное совмещение тёмного изображения фазовой пластинки, а также светлого изображения кольцевой диафрагмы при помощи вспомогательного микроскопа.

Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые бактерии. Для темнопольной микроскопии используют темнопольный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала. Перед началом работы свет устанавливают и центрируют по светлому полю, затем светлопольный конденсор удаляют и заменяют соответствующей системой (например, ОИ-10 или ОИ-21). Препарат готовят по методу «раздавленной капли», делая его как можно более тонким (толщина покровного стекла не должна быть толще 1 мм). Наблюдаемый объект выглядит как освещенный на тёмном поле. При этом лучи от осветителя падают на объект сбоку, а в линзы микроскопа поступают только рассеянные лучи (рис. 11-2). В качестве иммерсионной жидкости пригодно вазелиновое масло.

Фазово-контрастная микроскопия. Техника фазово-контрастной микроскопии

Фазово-контрастная микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты за счёт повышения их контрастности. При прохождении света через окрашеные объекты происходит изменение амплитуды световой волны, а при прохождении через неокрашенные - фазы световой волны, что используют для получения высококонтрастного изображения в фазово-контрастной (рис. 11-3) и интерференционной микроскопии. Для повышения контрастности фазовые кольца покрывают металлом, поглощающим прямой свет, не влияя на сдвиг фазы. В оптической системе микроскопа применяют специальный конденсор с револьвером диафрагм и центрирующим устройством; объективы заменяют на иммерсионные объективы-апохроматы.