Функции и строение тромбоцитов. Нормальный гемостаз Структура и функции тромбоцитов

Лекция КРОВЬ

Кровь циркулирует по кровеносным сосудам, поставляя всем органам кислород (из легких), питательные вещества (из кишечника), гормоны и др. и перенося от них к легким углекислый газ, а к органам выделения метаболиты, подлежащие обезвреживанию и выведению.

Таким образом, важнейшими функциями крови являются:

дыхательная (перенос кислорода из легких во все органы и углекислоты из органов в легкие);

трофическая (доставка органам питательных веществ);

защитная (обеспечение гуморального и клеточного иммунитета, свертывание крови при травмах);

выделительная (удаление и транспортировка в почки продуктов обмена веществ);

гомеостатическая (поддержание постоянства внутренней среды организма, в том числе иммунного гомеостаза);

регуляторная (перенос гормонов, факторов роста и других биологически активных веществ, осуществляющих регуляцию разнообразных функций).

Кровь состоит из форменных элементов и плазмы.

Плазма крови представляет собой межклеточное вещество жидкой консистенции. Она состоит из воды (90-93%) и сухого вещества (7-10%), в котором 6,6-8,5% белков и 1,5-3,5% других органических и минеральных соединений. К основным белкам плазмы крови относятся альбумины, глобулины, фибриноген и компоненты комплемента.

К форменным элементам крови относятся

эритроциты ,

лейкоциты

кровяные пластинки (тромбоциты).

Из них только лейкоциты являются истинными клетками; эритроциты и тромбоциты человека относятся к постклеточным структурам.

ЭРИТРОЦИТЫ

Эритроциты , или красные кровяные тельца, наиболее многочисленные форменные элементы крови (4,5 млн/mL у женщин and 5 млн/mL у мужчин – в среднем). Число эритроцитов у здоровых людей может варьировать в зависимости от возраста, эмоциональной и мышечной нагрузки, действия экологических факторов и др.

У человека и млекопитающих представляют собой безъядерные клетки, неспособные к делению.

Эритроциты образуются в красном костном мозге. Продолжительность жизни эритроцитов составляет около 120 дней, а затем старые эритроциты разрушаются макрофагами селезенки и печени (2.5 млн эритроцитов ежесекундно).

Эритроциты выполняют свои функции в кровеносных сосудах, которые в норме не покидают.

Функции эритроцитов :

дыхательная , обеспечивается наличием в эритроцитах гемоглобина (железосодержащий белковый пигмент), который определяет их цвет;

регуляторная и защитная – обеспечиваются благодаря способности эритроцитов переносить на своей поверхности биологически активные вещества, в том числе иммуноглобулины.

Форма эритроцитов

В норме в крови человека 80-90% составляют эритроциты двояковогнутой формы – дискоциты .

У здорового человека незначительная часть эритроцитов может иметь форму, отличающуюся от обычной: встречаются планоциты (с плоской поверхностью) и стареющие формы: сфероциты (шаровидные); эхиноциты (шиповидные); стоматоциты (куполообразные). Такое изменение формы обычно связано с аномалиями мембраны или гемоглобина у стареющих эритроцитов. При различных заболеваниях крови (анемиях, наследственных заболеваниях и др.) отмечается пойкилоцитоз – нарушения формы эритроцитов (примеры патологических формы эритроцитов: акантоциты, овалоциты, кодоциты, дрепаноциты (серповидные), шистоциты и др.)

Размеры эритроцитов

70% эритроцитов у здоровых людей – нормоциты с диаметром от 7,1 до 7,9 мкм. Эритроциты с диаметром менее 6,9 мкм называют микроцитами, эритроциты с диаметром более 8 мкм называются макроцитами , эритроциты с диаметром 12 мкм и более – мегалоцитами.

В норме количество микро- и макроцитов составляют по 15%. В том случае, когда количество микроцитов и макроцитов превышает пределы физиологической вариации, говорят об анизоцитозе . Анизоцитоз является ранним признаком анемии, а его степень говорит о тяжести анемии.

Обязательной составной частью популяции эритроцитов являются их молодые формы (1-5% от общего числа эритроцитов) – ретикулоциты . Ретикулоциты поступают в кровоток из костного мозга. Ретикулоциты содержат остатки рибосом и РНК, – выявляются в виде сеточки при суправитальном окрашивании, - митохондрии и к.Гольджи. Окончательная дифференцировка в течение 24-48 часов после выхода в кровоток.

Поддержание формы эритроцита обеспечивают белки примембранного цитоскелета.

В состав цитоскелета эритроцитов входят: примембранный белок спектрин , внутриклеточный белок анкирин , мембранные белки гликоферин и белки полос 3 и 4 . Спектрин участвует в поддержании двояковогнутой формы. Анкирин связывает спектрин с трансмембранным белком полосы 3.

Гликоферин пронизывает плазмолемму и выполняет рецепторные функции. Олигосахариды гликолипидов и гликопротеидов образуют гликокаликс. Они определяют антигенный состав эритроцитов. По содержанию агглютиногенов и агглютининов различают 4 группы крови. На поверхности эритроцитов имеется также резус-фактор – агглютиноген.

Цитоплазма эритроцитов состоит из воды (60%) и сухого остатка (40%), содержащего около 95% гемоглобина. Гемоглобин является дыхательным пигментом, имеющим в своем составе железосодержащую группу (гем ).

ЛЕЙКОЦИТЫ

Лейкоциты или белые кровяные клетки, представляют собой группу морфологически и функционально разнообразных подвижных форменных элементов циркулирующих в крови, могут переходить через стенку сосудов в соединительную ткань органов, где они выполняют защитные функции.

Концентрация лейкоцитов у взрослого человека составляет 4-9х10 9 /л. Величина этого показателя может варьировать в связи со временем суток, приемом пищи, характером выполняемой работы и другими факторами. Поэтому исследование показателей крови является необходимым для установления диагноза и назначения лечения. Лейкоцитоз - увеличение концентрации лейкоцитов в крови (чаще всего при инфекционных и воспалительных заболеваниях). Лейкопения – снижение концентрации лейкоцитов в крови (в результате тяжелых инфекционных процессов, токсических состояний, облучения).

По морфологическим признакам, из которых ведущим служит присутствие в их цитоплазме специфических гранул , и биологической роли лейкоциты подразделяют на две группы:

зернистые лейкоциты, (гранулоциты );

незернистые лейкоциты, (агранулоциты ).

Кгранулоцитам относятся

нейтрофильные,

эозинофильные

базофильные лейкоциты .

Для группы гранулоцитов характерно наличие сегментированных ядер и специфической зернистости в цитоплазме. Они образуются в красном костном мозге. Продолжительности жизни гранулоцитов в крови – от 3 до 9 дней.

Нейтрофильные гранулоциты - составляют 48 – 78% от общего числа лейкоцитов, их размер в мазке крови составляет 10-14 мкм.

В зрелом сегментоядерном нейтрофиле ядро содержит 3–5 сегментов, соединенных тонкими перемычками.

Для женщин характерно наличие в ряде нейтрофилов полового хроматина в виде барабанной палочки – тельце Барра.

Функции нейтрофильных гранулоцитов:

Уничтожение микроорганизмов;

Разрушение и переваривание поврежденных клеток;

Участие в регуляции деятельности других клеток.

Нейтрофилы поступают в очаг воспаления, где фагоцитируют бактерии и тканевые обломки.

Ядро нейтрофильных гранулоцитов имеет неодинаковое строение в клетках разной степени зрелости. На основании строения ядра различают:

юные,

палочкоядерные

сегментоядерные нейтрофилы .

Юные нейтрофилы (0,5%) имеют бобовидное ядро. Палочкоядерные нейтрофилы (1 - 6%) имеют сегментированное ядро в форме буквы S, изогнутой палочки или подковы. Увеличение в крови юных или палочкоядерных нейтрофилов свидетельствует о наличии воспалительного процесса или кровопотери, и такое состояние называют сдвигом влево . Сегментоядерные нейтрофилы (65%) имеют дольчатое ядро, представленное 3-5 сегментами.

Цитоплазма нейтрофилов слабооксифильна, в ней можно различить два типа гранул:

неспецифические (первичные, азурофильные)

специфические (вторичные).

Неспецифические гранулы являются первичными лизосомами и содержат лизосомальные ферменты и миелопероксидазу. Миелопероксидаза из перекиси водорода продуцирует молекулярный кислород, обладающий бактерицидным действием.

Специфические гранулы содержат бактериостатические и бактерицидные вещества – лизоцим, щелочную фосфатазу и лактоферрин. Лактоферрин связывает ионы железа, что способствует склеиванию бактерий.

Так как основная функция нейтрофилов - фагоцитоз, их еще называют микрофагами . Фагосомы с захваченной бактерией сначала сливаются со специфическими гранулами, ферменты которых убивают бактерию. Позднее к этому комплексу присоединяются лизосомы, гидролитические ферменты которых переваривают микроорганизмы.

Нейтрофильные гранулоциты циркулируют в периферической крови 8-12 часов. Срок жизни нейтрофилов 8-14 суток.

Эозинофильные гранулоциты составляют 0,5-5% всех лейкоцитов. Их диаметр в мазке крови 12-14 мкм.

Функции эозинофильных гранулоцитов:

Участие в аллергических и анафилактических реакциях

Ядро эозинофила имеет обычно двасегмента , в цитоплазме содержатся два типа гранул – специфические оксифильные и неспецифические азурофильные (лизосомы).

Для специфических гранул характерно наличие в центре гранулы кристаллоида , который содержит главныйщелочной белок (МВР) , богатый аргинином (обуславливает эозинофилию гранул) и обладает мощным антигельминтным, антипротозойным и антибактериальным эффектом.

Эозинофилы с помощью фермента гистаминазы нейтрализуют гистамин, выбрасываемый базофилами и тучными клетками, а также фагоцитируют комплекс Антиген-Антитело.

Базофильные гранулоциты самая малочисленная группа(0-1%) лейкоцитов и гранулоцитов.

Функции базофильных гранулоцитов:

регуляторная, гомеостатическая – гистамин и гепарин, содержащиеся в специфических гранулах базофилов, участвуют в регуляции процесса свертывания крови и проницаемости сосудов;

участие в иммунологических реакциях аллергического характера.

Ядра базофильных гранулоцитов слабо дольчатые, цитоплазма заполнена крупными гранулами, нередко маскирующими ядро и обладающими метахромазией , т.е. способностью изменять цвет примененного красителя.

Метахромазия обусловлена наличием гепарина . В гранулах содержатся также гистамин , серотонин, ферменты пероксидаза и кислая фосфатаза.

Быстрая дегрануляция базофилов происходит при реакциях гиперчувствительности немедленного типа (при астме, анафилаксии, аллергическом рините), действие выделяющиеся при этом веществ приводит к сокращению гладких мышц, расширению сосудов и повышению их проницаемости. На плазмолемме есть рецепторы к IgE.

К агранулоцитам относятся

лимфоциты;

моноциты .

В отличие от гранулоцитов агранулоциты:

Их ядра не сегментированы.

Лимфоциты составляют в крови 20-35% от всех лейкоцитов. Их размеры варьируют от 4 до 10 мкм. Различают малые (4,5-6 мкм), средние (7-10 мкм) и большие лимфоциты (10 мкм и более). Большие лимфоциты (молодые формы) у взрослых в периферической крови практически отсутствуют, встречаются лишь у новорожденных и детей.

Функции лимфоцитов:

Обеспечение реакций иммунитета;

Регуляция деятельности клеток других типов в иммунных реакциях.

Для лимфоцитов характерно округлое или бобовидное, интенсивно окрашенное ядро, так как содержит много гетерохроматина и узкий ободок цитоплазмы.

В цитоплазме содержится небольшое количество азурофильных гранул (лизосом).

По происхождению и функции различают Т-лимфоциты (образуются из стволовых клеток костного мозга и созревают в тимусе), В-лимфоциты (образуются в красном костном мозге).

В-лимфоциты составляют около 30% циркулирующих лимфоцитов. Их главная функция – участие в выработке антител, т.е. обеспечение гуморальногоиммунитета . При активации они дифференцируются в плазмоциты , которые вырабатывают защитные белки – иммуноглобулины (Ig), которые поступают в кровь и уничтожают чужеродные вещества.

Т-лимфоциты составляют около 70% циркулирующих лимфоцитов. Основными функциями этих лимфоцитов являются обеспечение реакций клеточного иммунитета и регуляция гуморального иммунитета (стимуляция или подавление дифференцировки В-лимфоцитов).

Среди Т-лимфоцитов выявлено несколько групп:

Т-хелперы ,

Т-супрессоры ,

цитотоксические клетки (Т-киллеры).

Продолжительность жизни лимфоцитов варьирует от нескольких недель до нескольких лет. Т-лимфоциты являются популяцией долгоживущих клеток.

Моноциты составляют от 2 до 9% от всех лейкоцитов. Являются самыми крупными клетками крови, их размер - 18-20 мкм в мазке крови. Ядра моноцитов - крупные, разнообразной формы: подковообразные, бобовидные, более светлые, чем у лимфоцитов, гетерохроматин рассеян мелкими зернами по всему ядру. Цитоплазма моноцитов имеет больший, чем у лимфоцитов объем. Слабобазофильная цитоплазма содержит азурофильную зернистость (многочисленные лизосомы), полирибосомы, пиноцитозные пузырьки, фагосомы.

Моноциты крови являются фактически незрелыми клетками, находящимися на пути из костного мозга в ткани. Они циркулируют в крови около 2-4 суток, затем мигрируют в соединительную ткань, где из них образуются макрофаги.

Главная функция моноцитов и образующихся из них макрофагов – фагоцитоз. Различные вещества, образующиеся в очагах воспаления и разрушения ткани, привлекают сюда моноциты и активируют моноциты /макрофаги. В результате активации увеличивается размер клетки, образуются выросты типа псевдоподий, усиливается метаболизм, и клетки выделяют биологически активные вещества цитокины- монокины, такие как интерлейкины (ИЛ-1, ИЛ-6), фактор некроза опухолей, интерферон, простагландины, эндогенные пирогенны и др.

Кровяные пластинки илитромбоциты представляют собой циркулирующие в крови безъядерные фрагменты цитоплазмы гигантских клеток красного костного мозга – мегакариоцитов.

Тромбоциты имеют округлую или овальную формы, размеры тромбоцитов 2-5 мкм. Продолжительность жизни тромбоцита – 8 дней. Старые и дефектные тромбоциты разрушаются в селезёнке (где депонируется одна треть всех тромбоцитов), печени и костном мозге. Тромбоцитопения – снижение числа тромбоцитов, наблюдается при нарушениях деятельности красного костного мозга, при СПИДе. Тромбоцитоз – увеличение числа тромбоцитов в крови, наблюдается при усиленной выработке в костном мозге, при удалении селезенки, при болевом стрессе, в условиях высокогорья.

Функции тромбоцитов:

Остановка кровотечения при повреждении стенки сосудов (первичный гемостаз);

Обеспечение свертывания крови (гемокоагуляция) - вторичный гемостаз;

Участие в реакциях заживления ран;

Обеспечение нормальной функции сосудов (ангиотрофическая функция).

Строение тромбоцитов

В световом микроскопе каждая пластинка имеет более светлую периферическую часть, называемую гиаломером и центральную более темную, зернистую часть, называемую грануломером . На поверхности тромбоцитов имеется толстый слой гликокаликса с большим содержанием рецепторов к различным активаторам и факторам свёртывания крови. Гликокаликс образует мостики между мембранами соседних тромбоцитов при их агрегации.

Плазмолемма образует инвагинации с отходящими канальцами, которые участвуют в экзоцитозе гранул и эндоцитозе.

В тромбоцитах хорошо развит цитоскелет, представленный актиновыми микрофиламентами, пучками микротрубочек и промежуточными виментиновыми филаментами. Большую часть элементов цитоскелета и две системы трубочек содержит гиаломер.

Грануломер содержит органеллы, включения и специальные гранулы нескольких типов:

ά-гранулы – самые крупные (300-500 нм), содержат белки гликопротеины, принимающие участие в процессах свертывания крови, факторы роста.

δ -гранулы, немногочисленные, накапливают серотонин, гистамин, ионы кальция, АДФ и АТФ.

λ-гранулы : мелкие гранулы. содержащие лизосомные гидролитические ферменты и фермент пероксидазу.

Содержимое гранул при активации выделяется по открытой системе каналов, связанных с плазмолеммой.

В кровотоке тромбоциты представляют собой свободные элементы, не слипающиеся ни друг с другом, ни с поверхностью эндотелия сосудов. При этом эндотелиоциты в норме вырабатывают и выделяют вещества, угнетающие адгезию и препятствующие активации тромбоцитов.

При повреждении стенки сосуда микроциркуляторного русла, которые наиболее часто травмируются, кровяные пластинки служат основными элементами в остановке кровотечения.

Составляют в 1 л крови 250-300 х 1012, представляют собой частицы цитоплазмы, отщепляющиеся от гигантских клеток красного костного мозга - мегакариоцитов. Диаметр тромбоцитов 2-3 мкм. Тромбоциты состоят из гиаломера, являющегося их основой, и хромомера, или грануломера.

Плазмолемма плазмоцигтюв покрыта толстым (15-20 нм) ишкокаликсом, образует инвагинации в виде канальцев, отходящих от цитолеммы. Это открытая система канальцев, через которые из тромбоцитов выделяется их содержимое, а из плазмы крови поступают различные вещества. В плаз-молемме имеются гликопротеины - рецепторы. Гликопроте-ин PIb захватывает из плазмы фактор фон Виллебранда (vWF). Это один из основных факторов, обеспечивающих свертывание крови. Второй гликопротеин, Pllb-IIIa, является рецептором фибриногена и принимает участие в агрегации тромбоцитов.

Гиаломер - цитоскелет тромбоцита представлен актино-выми филаментами, расположенными под цитолеммой, ■■Пучками микротубул, прилежащих к цитолемме и расположенных циркулярно. Актиновые филаменты принимают Участие в сокращении объема тромба.

[^ Плотная тубулярная система тромбоцита состоит из ТРУбочек, сходных с гладкой ЭПС. На поверхности этой си- с**мы синтезируются циклооксигеназы и простагландины, ■Тих трубочках связываются двухвалентные катионы и де- Г^Вфуются ионы Са2+. Кальций способствует адгезии и аг- "~*Ции тромбоцитов. Под влиянием циклооксигеназ арахи- *™»°вая кислота распадается на простагландины и тромбок- ** ■ ni3" К0Т0Рые стимулируют агрегацию тромбоцитов. ^Р включает органеллы (рибосомы, лизосомы,

Тромбоциты - форменные элементы крови, количество которых составляет 150-400 109 / л. Это безъядерные, лишены пигментов круглые структуры, имеющие вид дисков диаметром около 3,6 мкм. Они образуются в костном мозге из крупных клеток-мегакариоцитов путем фрагментации цитоплазмы, их количество в крови постоянно. Однако при интенсивном использовании скорость образования новых тромбоцитов может увеличиться в 8 раз. Стимуляцию тромбоцитопоезу вызывает тромбопоэтин, который производится в печени и частично в почках. Активация тромбоцитопоезу может осуществляться и другими гемопоэтическими факторами, в частности интерлейкинами (1 / 1-3, ИЛ-6, ИЛ-11), но этот процесс не является специфичным по сравнению с тромбопоэтина.

Структура и функции тромбоцитов

Плотные гранулы (β) содержат небелковые вещества: АДФ и серотонин; факторы, способствующие агрегации тромбоцитов, а также антиагрегантное АТФ и Са2. Лизосомальные гранулы содержат гидролитические ферменты, а пероксисомы - каталазу. Внешняя оболочка тромбоцитов и ВКС покрытые гликопротеинами, способствующие адгезии и агрегации тромбоцитов.

На мембране тромбоцитов имеются рецепторы для физиологических активаторов тромбоцитов (АТФ, адреналин, серотонин, тромбоксан Aj).

Функции тромбоцитов:

■ тромбоциты быстро запускают систему гемостаза. Благодаря адгезии (прилипание) и агрегации (скопление) тромбоцитов образуется белый тромб в сосудах микроциркуляторного русла

■ местно в поврежденном участке выделяют вещества, сужающие сосуды;

■ активируют начало коагуляционного гемостаза с образованием фибринового тромба,

■ регулируют местные воспалительные реакции.

В состоянии покоя тромбоциты имеют цитоплазматическую мембрану, местами инвагинуе и соединяется с сетью каналов, называются открытой канальцевой системы (ВКС) внутри тромбоцитов. Вторая система внутренней оболочки (плотная тубулярная система) образуется из эндоплазматической сети мегакариоцитов и не соединяется с внеклеточным пространством. В цитоплазме неактивированных тромбоцитов находятся гранулы, среди которых α-гранулы, плотные β-гранулы, гранулы лизосомы и пероксисомы (рис. 9.20).

Больше всего в тромбоците α-гранул, содержащих различные пептиды, участвующих в механизмах коагуляции, воспаление, иммунитета, репарации и модуляции этих процессов.

РИС. 9.20.

Активация тромбоцитов осуществляется только тогда, когда повреждено сосудистый эндотелий и есть контакт с субэндотелиальным матриксом, где находятся коллаген, другие белки, фактор Виллебранда (производится эндотелием). Рецепторы мембраны тромбоцитов связываются с фактором Виллебранда (ФВ), коллагеном, другими белками, что приводит к активации тромбоцитов, их адгезии, изменения формы, необратимой секреции плотных гранул и α-гранул. Изменение формы тромбоцитов обусловлена внутриклеточной системой сократительных микрофиламентов, что приводит к увеличению поверхности их мембраны и выделение через открытые ее канальцы веществ, участвующих в коагуляционном гемостазе.

К поверхности мембраны прикрепляется фибриноген благодаря изменению состояния ее гликопротеинов, способствует агрегации тромбоцитов. В тромбоцитах происходит синтез тромбоксана А2 с арахидоновой кислоты, высвобождается мембраной плотной тубулярной системы, синтез тромбоцитактивуючого фактора (ТАФ), который усиливает агрегацию тромбоцитов и активирует нейтрофилы. Образование тромбина также усиливает агрегацию тромбоцитов.

Известно, что тромбоциты синтезируют и депонированных в α-гранулах факторы свертывания крови V, VIII, XIII, фактор Виллебранда и фибриноген, выходящих наружу методом экзоцитоза.

Липопротеины мембраны тромбоцитов катализируют некоторые факторы при образовании протромбиназы. Активированные тромбоциты связывают тромбин и тромбомодулин (компонент α-гранул), который способствует активации антикоагулянта белка С.

Тромбоциты выделяют факторы роста с α-гранул в зону повреждения, способствует пролиферации фибробластов и репарации поврежденной ткани. Они имеют связь с системой гуморального иммунитета и связывают IgG, который Эндоцитоз попадает в клетку, сохраняется в а-гранулах, чтобы потом секретироваться путем экзоцитоза.

РИС. 9.21. Последовательность этапов сосудисто-тромбоцитарного гомеостаза. ФВ - фактор Виллебранда, ПФ-6 - тромбостенин

Кровяные пластинки, которые призваны бороться с внезапными кровопотерями, называются тромбоцитами. Они аккумулируются в местах повреждения любых сосудов и закупоривают их специальной пробкой.

Внешний вид пластинок

Под микроскопом можно рассмотреть строение тромбоцитов. Они выглядят как диски, диаметр которых колеблется от 2 до 5 мкм. Объем каждого из них составляет порядка 5-10 мкм 3 .

По своей структуре тромбоциты являются сложным комплексом. Он представлен системой микротрубочек, мембран, органелл и микрофиламентов. Современные технологии позволили разрезать распластанную пластинку на две части и выделить в ней несколько зон. Именно так смогли определить особенности строения тромбоцитов. Каждая пластинка состоит из нескольких слоев: периферическая зона, золь-гель, внутриклеточные органеллы. У каждого из них свои функции и предназначение.

Внешний слой

Периферическая зона состоит из трехслойной мембраны. Строение тромбоцитов таково, что на внешней ее стороне находится слой, в котором содержатся плазматические факторы, отвечающие за специальные рецепторы и энзимы. Толщина его не превышает 50 нм. Рецепторы этого слоя тромбоцитов отвечают за активацию указанных клеток и их способность к адгезии (присоединению к субэндотелию) и агрегации (возможности соединяться между собой).

Также мембрана содержит особый фосфолипидный фактор 3 или так называемую матрицу. Эта часть отвечает за формирование активных коагуляционных комплексов вместе с плазменными факторами, отвечающими за свертывание крови.

Помимо этого, в ней находится Важным ее компонентом является фосфолипаза А. Именно она образовывает указанную кислоту, необходимую для синтеза простагландинов. Они, в свою очередь, предназначены для формирования тромбоксана А 2 , который необходим для мощной агрегации тромбоцитов.

Гликопротеины

Строение тромбоцитов не ограничивается наличием внешней мембраны. В ее липидном бислое находятся гликопротеины. Именно они предназначены для связывания тромбоцитов.

Так, гликопротеин I является рецептором, который отвечает за присоединение к коллагену субэндотелия указанных кровяных клеток. Он обеспечивает адгезию пластинок, их распластывание и связывание их еще с одним белком - фибронектином.

Гликопротеин II предназначен для всех видов агрегации тромбоцитов. Он обеспечивает связывание на этих кровяных клетках фибриногена. Именно благодаря этому беспрепятственно продолжается процесс агрегации и сокращения (ретракции) сгустка.

А вот гликопротеин V предназначен для поддержания соединения тромбоцитов. Он гидролизируется тромбином.

Если в указанном слое мембраны тромбоцитов снижается содержание различных гликопротеинов, то это становится причиной повышенной кровоточивости.

Золь-гель

Вдоль второго слоя тромбоцитов, располагающегося под мембраной, идет кольцо микротрубочек. Строение тромбоцитов в крови человека таково, что указанные трубочки являются их сократительным аппаратом. Так, при стимуляции этих пластин кольцо сжимается и смещает гранулы к центру клеток. В результате они сжимаются. Все это вызывает секрецию их содержимого наружу. Это возможно благодаря специальной системе открытых канальцев. Такой процесс называется «централизация гранул».

При сокращении кольца микротрубочек также становится возможным образование псевдоподий, что только благоприятствует увеличению способности агрегации.

Внутриклеточные органеллы

Третий слой содержит гликогеновые гранулы, митохондрии, α-гранулы, плотные тела. Это так называемая зона органелл.

Плотные тела содержат в себе АТФ, АДФ, серотонин, кальций, адреналин и норадреналин. Все они необходимы для того, чтобы могли работать тромбоциты. Строение и функции этих клеток обеспечивают адгезию и Так, АДФ вырабатывается при прикреплении тромбоцитов к стенкам сосудов, он же отвечает за то, чтобы указанные пластинки из кровотока продолжали присоединяться к тем, которые уже приклеились. Кальций регулирует интенсивность адгезии. Серотонин вырабатывается тромбоцитом при высвобождении гранул. Именно он обеспечивает в месте разрыва их просвета.

Альфа-гранулы, находящиеся в зоне органелл, способствуют формированию тромбоцитарных агрегатов. Они отвечают за стимуляцию роста гладких мышц, восстановление стенок сосудов, гладких мышц.

Процесс образования клеток

Чтобы разобраться с тем, каково строение тромбоцитов человека, необходимо понять, откуда они берутся и как формируются. Процесс их появления сосредоточен в Он разделяется на несколько стадий. Вначале формируется колониеобразующая мегакариоцитарная единица. На протяжении нескольких этапов она трансформируется в мегакариобласт, промегакариоцит и в конечном итоге в тромбоцит.

Ежедневно человеческий организм продуцирует порядка 66000 этих клеток в расчете на 1 мкл крови. У взрослого человека в сыворотке должно находиться от 150 до 375, у ребенка от 150 до 250 х 10 9 /л тромбоцитов. При этом 70 % их них циркулирует по организму, а 30 % накапливаются в селезенке. В случае необходимости этот и высвобождает кровяные пластинки.

Основные функции

Для того чтобы понять, для чего в организме необходимы кровяные пластинки, мало разобраться с тем, какие особенности строения тромбоцитов человека. Они предназначены в первую очередь для формирования первичной пробки, которая должна закрыть поврежденный сосуд. Кроме того, тромбоциты предоставляют свою поверхность для того, чтобы ускорить реакции плазменного свертывания.

Помимо этого, было установлено, что они нужны для регенерации и заживления различных поврежденных тканей. Тромбоциты продуцируют факторы роста, предназначенные для стимуляции развития и деления всех поврежденных клеток.

Примечательно, что они могут быстро и необратимо переходить в новое состояние. Стимулом для их активации может стать любое изменение окружающей среды, в том числе и простое механическое напряжение.

Особенности тромбоцитов

Живут указанные кровяные клетки недолго. В среднем продолжительность их существования составляет от 6,9 до 9,9 дней. После окончания указанного периода они разрушаются. В основном этот процесс проходит в костном мозге, но также в меньшей степени он идет в селезенке и печени.

Специалисты выделяют пять различных типов кровяных пластинок: юные, зрелые, старые, формы раздражения и дегенеративные. В норме в организме должно быть более 90% зрелых клеток. Только в таком случае строение тромбоцитов будет оптимальным, а они смогут выполнять все свои функции в полном объеме.

Важно понимать, что снижение концентрации этих является причиной кровотечений, которые сложно остановить. А увеличение их количества является причиной развития тромбоза - появления сгустков крови. Они могут закупоривать кровеносные сосуды в различных органах тела или полностью перекрывать их.

В большинстве случаев при различных проблемах строение тромбоцитов не меняется. Все заболевания связаны с изменением их концентрации в кровеносной системе. Уменьшение их количества называется тромбоцитопения. Если их концентрация увеличивается, то речь идет о тромбоцитозе. При нарушении активности этих клеток диагностируют тромбастению.

Тромбоциты и гемостаз

М.А. Пантелеев1-5, А.Н. Свешникова1-3

1Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН, Москва; 2ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России, Москва; 3физический факультет ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»;

4ФГБУ ГНЦМинздрава России, Москва; 5ООО «ГемаКор», Москва

Контакты: Михаил Александрович Пантелеев [email protected]

Тромбоциты представляют собой безъядерные клеточные фрагменты, играющие важную роль в гемостазе, остановке кровотечения при повреждении, а также в патологическом тромбообразовании. Главным способом выполнения своей функции у тромбоцитов является формирование агрегатов, перекрывающих место повреждения. Способность к агрегации они получают в результате переходного процесса, называемого активацией. Несмотря на относительно простую и однозначную функцию, устройство тромбоцитов весьма сложно: они имеют почти полноценный набор органелл, включая эндоплазматическийретикулум, митохондрии и другие образования; при активации тромбоциты секретируют разнообразные гранулы и вступают во взаимодействия с белками плазмы и клеток крови и других тканей; сама их активация управляется многочисленными рецепторами и сложными сигнальными каскадами. В настоящем обзоре мы рассмотрим устройство тромбоцита, механизмы его функционирования в норме и патологии, методы диагностики нарушений функции тромбоцитов и подходы к их коррекции. Особое внимание будет уделено тем областям науки о тромбоцитах, где до сих пор таятся загадки.

Ключевые слова: структура тромбоцитов, функция тромбоцитов

Platelets and hemostasis M.A. Panteleev1-5, A.N. Sveshnikova1-3

"Theoretical Problems Center of Physical and Chemical Pharmacology, Russian Academy of Sciences, Moscow; 2Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology named after Dmitriy Rogachev,

Ministry of Health of Russia, Moscow; 3Lomonosov Moscow State University, Faculty of Physics, Moscow; 4Hematological Research Center, Ministry of Health of Russia, Moscow; 5HemaCore Company, Moscow

Platelets are anuclear cell fragments playing important role in hemostasis, termination of bleeding after damage, as well as in pathological thrombus formation. The main action of platelets is the formation of aggregates, overlapping the injury. They obtained the ability to aggregate by the transition process called activation. Despite the relatively simple and definite function platelet structure is very difficult: they have almost a full set of organelles, including the endoplasmic reticulum, mitochondria and other entities. When activated platelets secrete various granules interact with plasma proteins and red blood cells and other tissues. Their activation is controlled by multiple receptors and complex signaling cascades. In this review platelet structure, mechanisms of its functioning in health and disease, diagnostic methods of platelet function and approaches to their correction were considered. Particular attention will be given to those areas of the science of platelets, which still lay hidden mysteries.

Key words: platelet structure, platelet function

Введение

Тромбоциты представляют собой маленькие, 2-4 микрометра диаметром, безъядерные клеточные фрагменты (хотя иногда их называют клетками), циркулирующие в кровотоке в концентрации 200-400 тыс. на микролитр и отвечающие за ключевые этапы процесса остановки кровотечения - гемостаза. В случае ранения они способны прикрепляться к поврежденным тканям и друг к другу, формируя тромбоцитарную пробку-агрегат (рис. 1), прекращающую потерю крови и препятствующую попаданию микробов в систему кровообращения. Это не единственный механизм гемостаза, но крайне важный. Наследственные и приобретенные нарушения функции тромбоцитов, такие

как тромбастения Гланцмана или иммунная тромбо-цитопения, являются тяжелыми заболеваниями, для которых характерны опасные кровотечения. Тромбоциты принимают активное участие и в других составляющих механизма гемостаза: одни секретируемые ими вещества вызывают локальную вазоконстрикцию, а другие - ускоряют реакции свертывания крови.

С другой стороны, избыточная функция или количество тромбоцитов, или иные нарушения в сердечно-сосудистой системе могут приводить к формированию тромбоцитарных агрегатов не вне, а внутри сосуда - тромбов (рис. 2). Тромбоцитарные тромбы могут образовываться в самых разных ситуациях и играют центральную роль в таких патологических состо-

Рис. 1. Гемостатический агрегат, формируемый тромбоцитами в артериоле собаки. Наблюдаемая под световым микроскопом картина тромбоцитарной пробки (Н), перекрывающая разорванный сосуд (V). Биопсия произведена через 3 мин после ранения. Многочисленные эритроциты в верхней части снимка располагаются в просвете раны, тянущейся слева направо. Шкала размера в правом нижнем углу соответствует 10 микрометрам. Воспроизведено из

Рис. 2. Формирование тромба в артериоле. Интравитальная ДИК-микроскопия тромбообразования в сосуде крысы, поврежденном посредством фотоактивации красителя бенгальский розовый. Тромб на сосудистой стенке, покрывающий место повреждения, указан в правой верхней части снимка. В нем можно различить отдельные тромбоциты и заметить, что они сохраняют дисковидную форму на первых этапах прикрепления. Направление потока указано стрелкой. Шкала масштаба соответствует 5 микрометрам. Воспроизведено из

яниях, как инфаркты и инсульты. Таким образом, они отвечают за львиную долю смертности и инвалидности в современном мире, а противотромбоцитарные препараты, такие как клопидогрел, занимают почетные места в списке наиболее продаваемых лекарств на планете.

Тромбоциты во многих отношениях устроены просто: у них нет ядра, нет или практически нет синтеза белка, они не могут расти или делиться. Задача тромбоцита - приклеиться к месту повреждения - тоже выглядит простой и однозначной по сравнению с задачами практически любой иной клетки. Но на практике оказывается, что эта простота обманчива. Для выполнения своей функции они должны активироваться в процессе, который управляется добрым десятком активаторов, действующих через многочисленные рецепторы. Сеть сигнальных путей в тромбоците, управляющих его ответом, является сложной и плохо изученной. Сам по себе ответ тромбоцита представляет собой не простое «приклеивание», а включает десятки функций, начиная от первичной адгезии и заканчивая везикуляцией.

Кроме фундаментальных сложностей, тромбоциты таят в себе немало практических загадок: в настоящий момент в руках врачей нет ни сколько-нибудь адекватного теста для оценки функции тромбоцитов, ни действенного инструмента ее улучшения. Несмотря на огромный прогресс, достигнутый в конце XX века в связи с разработкой лекарственных препаратов-антагонистов гликопротеина IIb-IIIa и рецептора P2Y12, подавление активности тромбоцитов в целях борьбы с тромбозами все еще не является решенной проблемой. Наконец, сейчас разворачивается интенсивное исследование роли тромбоцитов за пределами гемостаза - в ангиогенезе, иммунитете и других системах.

Как клинические, так и биологические исследования тромбоцитов привлекают огромный интерес специалистов во всем мире. Практически каждый год приносит нам новые открытия, и представления о важнейших процессах буквально за последние годы претерпели радикальные изменения. В настоящем обзоре мы постарались сосредоточиться на фундаментальных представлениях о тромбоците и рассказать о последних достижениях в понимании его функционирования. Тем, кто желает ближе познакомиться с разными аспектами жизни этой удивительной клетки, можно порекомендовать основополагающий учебник А.В. Мазурова . Владеющие английским языком найдут ценную информацию в учебнике-справочнике Platelets под редакцией Алана Майкельсона , который регулярно переиздается.

Строение тромбоцита

В исходном, неактивированном виде тромбоциты напоминают двояковыпуклые «тарелочки» (рис. 3, слева). Благодаря своему маленькому размеру (2-4 микрона в диаметре) они свободно проходят через капилляры,

Рис. 3. Тромбоциты. Электронная микрофотография неактивированных тромбоцитов, сохраняющих дисковидную форму (слева), и активированных АДФ тромбоцитов в агрегате (справа). Воспроизведено из

так что их форма постоянна, в отличие от вынужденных протискиваться через капилляры эритроцитов. Только при активации форма тромбоцита меняется, становясь в большинстве случаев амебовидной (рис. 3, справа). Форма тромбоцита поддерживается как спек-триновым цитоскелетом, придающим их оболочке упругость, так и кольцом из тубулиновых микротрубочек (рис. 4), которое разрушается при активации. Цитоплазма клетки содержит многочисленные гранулы, главными из которых являются плотные гранулы, содержащие преимущественно низкомолекулярные вещества, такие как серотонин и аденозиндифосфат (АДФ), и альфа-гранулы, содержащие белки - фибриноген, тромбоспондин, Р-селектин, фактор свертывания V, фактор фон Виллебранда и многие другие . Содержимое этих гранул секретируется при актива-

ции. Важно отметить, что форма тромбоцита во многих отношениях является иллюзорной. Его внутренняя среда на самом деле представляет собой сплошную «губку», сеть мембранных каналов, которая служит дополнительным источником мембранной поверхности при активации и способствует секреции гранул .

Способность к активации - быстрому и в большинстве случаев необратимому переходу в некое новое состояние - является главным качеством тромбоцита. Стимулом активации может служить практически любое значительное возмущение окружающей среды, вплоть до простого механического напряжения. Однако основными физиологическими активаторами тромбоцитов считаются: 1) коллаген - главный белок внеклеточного матрикса; 2) тромбин - сериновая про-теиназа, центральный фермент плазменной системы свертывания; 3) АДФ - адениновый нуклеотид, который выделяется из разрушенных клеток сосуда или секре-тируется плотными гранулами самих тромбоцитов; 4) тромбоксан А2 - липид из класса эйкозаноидов, синтезируемый и выделяемый тромбоцитами.

Действие каждого из тромбоцитарных активаторов опосредуется через специализированные рецепторы в мембране тромбоцита. Так, коллаген активирует тромбоциты через гликопротеин VI, тромбин имеет 2 главных протеиназ-активируемых рецептора PAR1 и PAR4, действие АДФ происходит через пуринорецепторы P2Y1 и P2Y12. Стимуляция любого из рецепторов ведет к активации сложной сети каскадов внутриклеточной сигнализации, которые управляют ответом клетки; причем разные рецепторы в целом запускают разные пути.

Мембрана

Открытая канальцевая система

Кольцо из микротрубочек

Плотные гранулы

а-гранулы

Митохондрии

Плотная трубчатая система

Гликоген

Плотные гранулы

Рис. 4. Структура тромбоцита. На схеме слева можно различить основные элементы структуры тромбоцита, наблюдаемые под электронным микроскопом. Воспроизведено из . Справа показана трехмерная реконструкция внутренностей тромбоцита по данным электронной томографии. Обратите внимание, что показанная синим каналикулярная система занимает огромную долю объема клетки. Воспроизведено из

Активация тромбоцитов внешне проявляется многочисленными внутренними перестройками и изменениями свойств, основными среди которых считаются: 1) изменение формы на амебовидную, для части тромбоцитов - сферическую ; 2) усиление способности к адгезии - прикреплению к месту повреждения ; 3) появление способности к агрегации - прикреплению к другим тромбоцитам с целью формирования полноценной пробки; 4) секреция описанных выше многочисленных низко- и высокомолекулярных соединений из плотных гранул, альфа-гранул и других источников; 5) экспонирование прокоагулянтной мембраны.

Часть этих свойств служит для реализации главной функции тромбоцитов - формирования гемостатичес-кой пробки, другая - для ускорения реакций свертывания крови. Так, экспонирование прокоагулянтной мембраны и секреция альфа-гранул необходимы для осуществления именно второй функции тромбоцитов.

Свертывание крови представляет собой каскад реакций в плазме крови, который заканчивается формированием сети волокон фибрина и переводом крови из жидкого состояния в желеобразное . Многие ключевые реакции свертывания являются мембранно-зависимыми (рис. 5), ускоряясь на многие порядки в присутствии отрицательно заряженных фосфоли-пидных мембран, с которыми белки свертывания связываются посредством так называемых кальциевых мостиков. В нормальном состоянии мембрана тромбоцитов не поддерживает реакций свертывания. Отрицательно заряженные фосфолипиды, в первую очередь фосфатидилсерин, сосредоточены на внутреннем

слое мембраны, а фосфатидилхолин внешнего слоя связывает факторы свертывания гораздо хуже. Несмотря на то, что некоторые факторы свертывания могут связываться и с неактивированными тромбоцитами, это не приводит к формированию активных ферментативных комплексов.

Активация тромбоцита, предположительно, приводит к активации фермента скрамблазы, который начинает быстро, специфично, двусторонне и АДФ-независимо перебрасывать отрицательно заряженные фосфолипиды из одного слоя в другой. В результате происходит ускоренное установление равновесия, при котором концентрация фосфатидилсерина в обоих слоях становится одинаковой. Кроме того, при активации имеет место экспозиция и/или конформаци-онное изменение многих трансмембранных белков внешнего слоя мембраны, и они приобретают способность специфически связывать факторы свертывания, ускоряя реакции с их участием. Что интересно, только часть тромбоцитов проявляет такие свойства при активации .

Вообще говоря, активированное состояние тромбоцита может быть разным: активация тромбоцитов имеет несколько степеней, и экспрессия прокоагулянт-ной поверхности является одной из высших. Только тромбин или коллаген могут вызывать такой сильный ответ. Более слабые активаторы, особенно АДФ, могут вносить вклад в работу сильных активаторов . Однако они не способны самостоятельно вызвать выход фосфатидилсерина на внешний слой мембраны; их эффекты сводятся к изменению формы, агрегации и секреции части гранул.

Рис. 5. Мембранные реакции свертывания крови. Активация тромбоцитов ведет к появлению фосфатидилсерина во внешнем слое мембраны тромбоцитов. Факторы свертывания связываются с такими мембранами посредством кальциевых мостиков, формируя комплексы белков, в которых реакции свертывания ускоряются на порядки. На иллюстрации изображен комплекс протромбиназы, состоящий из факторов Ха, Уа, II, находящийся на поверхности бислойной мембраны

Как работает тромбоцит

Наиболее распространенным способом тестирования состояния системы тромбоцитарного гемостаза в современной диагностической практике является агрегация, в которой по оптической плотности оценивается эффект добавления к суспензии тромбоцитов некоторого активатора. Активатор, чаще всего АДФ или коллаген, добавляется к обогащенной тромбоцитами плазме крови при постоянном перемешивании на протяжении нескольких минут. Тромбоциты активируются, взаимодействуют друг с другом, и происходит формирование агрегатов, которое можно заметить по уменьшению мутности суспензии, вызванному уменьшением количества рассеивающих свет частиц. Существуют варианты теста агрегации, связанные с иными принципами детекции: например, можно измерить агрегацию тромбоцитов в цельной крови, если использовать импедансный метод вместо оптического.

Возможно, именно в связи с распространенностью теста агрегации за последние десятилетия в умах многих специалистов утвердилось представление, что формирование тромбоцитарного тромба или гемостатической пробки в организме происходит похожим способом: сначала активация (например, выделившимся из кле-

ток поврежденной стенки сосуда АДФ), а потом агрегация. Несмотря на то, что исследование роста тромбо-цитарного тромба в проточных камерах имеет историю длиной почти в полвека, только в последние десятилетия этот традиционный взгляд начал подвергаться сомнению .

Рассмотрим первую стадию формирования тромба: адгезии тромбоцитов к коллагену, экспонированному в месте повреждения. Попробуем оценить времена и расстояния, типичные для этого процесса. Пусть характерный размер области повреждения будет составлять, скажем, l = 10 микрометров (1 оторвавшаяся клетка эндотелия). Пусть скорость потока будет артериальной, это означает градиент скорости потока на стенке около u = 1000 с - 1. Тогда тромбоцит, имеющий характерный размер (по порядку величины) около x = 1 микрометра, будет двигаться около стенки со скоростью v = x х u = 1000 микрометров в секунду. Это означает, что он пролетит над местом повреждения за время l/v = 10 микросекунд при том, что типичное время активации тромбоцита составляет минуты, для каких-то событий (скажем, активация интегринов) несколько секунд, но никак не одну сотую секунды. Отсюда следует единственный возможный вывод, который к настоящему моменту подкреплен экспериментально : чтобы нормально активироваться, тромбоцит должен сначала прикрепиться к месту повреждения.

Более того, то же самое применимо и к последующим событиям увеличения размера тромба - агрегации. Тромбоцит, проплывающий над растущим в артерии тромбом, должен успеть присоединиться к нему за сотые доли секунды. Поэтому агрегация в организме может идти тоже только одним образом: сначала агрегация, а потом активация.

Еще одна проблема - это перемещение тромбоцита в сосуде поперек потока крови. Если бы тромбоциты были равномерно распределены в крови и спокойно перемещались с ламинарным потоком вдоль сосуда (а при ранении - вдоль раны), каждый по своей линии тока, то они не могли бы подойти к месту повреждения, чтобы выполнить свою задачу в гемостазе: для адгезии к месту повреждения или присоединения к уже активированному тромбоциту в тромбе необходимо воздействие какой-то физической силы, приводящей клетки в контакт. В тестах in vitro эта задача выполняется обычно магнитной мешалкой; а что работает в организме?

Вышеописанные рассуждения не могут, разумеется, служить доказательством новой картины тромбо-цитарного гемостаза и тромбоза. Эта новая картина, которая будет изложена ниже, сложилась в последние 10 лет в результате активной экспериментальной работы многих исследователей, ведущую роль среди которых играет лаборатория Shaun P. Jackson в Австралии ; при этом подавляющее большинство результатов получено с помощью видеомикроскопических

наблюдений за тромбообразованием in vivo. Представленные вниманию читателя численные оценки призваны лишь показать нереальность и внутреннюю противоречивость традиционного представления об агрегации тромбоцитов.

Как же происходит формирование тромбоцитар-ного тромба в реальности?

Первым шагом является вытеснение тромбоцитов к стенкам сосуда, осуществляемое эритроцитами. Красные клетки крови занимают почти половину ее объема, они на порядок превосходят тромбоциты как по концентрации, так и по массе. Столкновения эритроцитов, двигающихся с разными скоростями на разных линиях тока, между собой ведут к их перераспределению и концентрации у оси сосуда. Многие детали этого процесса неясны, но подобные перераспределения наблюдались в суспензиях частиц самого разного типа, не только в крови . Легкие и малочисленные тромбоциты оказываются постоянно вытеснены на периферию, что крайне удобно, так как именно там, около потенциальных мест повреждения, находится их рабочее место; таким образом, локальная концентрация тромбоцитов у стенки сосуда на порядок превышает среднюю по крови.

Более того, даже у стенок сосуда тромбоциты постоянно терпят столкновения с эритроцитами, что ведет фактически к тому самому перемешиванию, которое необходимо для возникновения взаимодействия . Благодаря таким столкновениям тромбоциты часто прижимаются к стенке, и если там оказывается место повреждения, они могут к нему прикрепиться. Помимо 2 главных механизмов, для которых построены надежные теории, - вытеснения и постоянного толкания - сейчас обсуждаются и другие, но бесспорным является экспериментальный факт: присутствие эритроцитов больше чем в 10 раз увеличивает скорость роста тромбоцитарного агрегата на поврежденной поверхности .

Второй проблемой является необходимость быстрой и бережной остановки тромбоцита, оказавшегося у места повреждения или около растущего тромба. Чтобы принять участие в формировании гемостати-ческой пробки или тромба, тромбоцит должен погасить свою немалую скорость. Для этого служит специальный рецептор на тромбоцитах, гликопротеин Ib-V-IX, и растворенный в крови фактор фон Вил-лебранда (рис. 6). Этот фактор, циркулирующий в виде больших мультимеров до 100 нанометров в диаметре, способен обратимо связываться с коллагеном и тромбоцитами в составе тромба, так что он быстро покрывает их. Проносящиеся мимо тромбоциты цепляются за фактор фон Виллебранда и начинают останавливаться. Если бы они связывали коллаген напрямую, то резкая их остановка могла бы повредить, но слабо привязанный фактор фон Виллебранда может отсоединяться и вновь присоединяться к коллагену, так что тромбоциты могут достаточно быстро ос-

тановиться, проскользив всего несколько своих длин, как самолет, садящийся на брюхо.

Активация в таком подходе оказывается не первой, а последней стадией в формировании тромба. Обратимо связавшийся с местом повреждения тромбоцит может оторваться; однако активация способна его стабилизировать. Тромбоциты первого слоя, севшие непосредственно на коллаген, активируются коллагеном же через рецептор гликопротеин VI и затем прочно связываются с коллагеном через рецептор ин-тегрин а2р1: белки этого семейства способны менять свою конформацию и прочность связывания с мишенью под действием внутриклеточных сигналов (рис. 6). В своем обычном состоянии он не взаимодействует с коллагеном, а при активации крепится к нему прочно.

Прикрепление следующих слоев тромбоцитов, т. е. собственно рост тромба, происходит аналогичным образом: сначала клетки непрочно садятся на фактор фон Виллебранда, а после активации надежно закрепляются через рецепторы-интегрины. Разница заключается в том, что тромбоциты между собой связываются через другой интегрин, называемый аПbp3 (или гликопротеин Пb-Шa): эти рецепторы «хватают» с 2 сторон молекулы фибриногена и через такие «фибрино-геновые мостики» связывают отдельные тромбоциты. Второе отличие заключается в том, что следующие слои тромбоцитов активируются не контактом с коллагеном (который уже закрыт первым слоем), а растворимыми активаторами, которые либо секретируются самими тромбоцитами (АДФ, тромбоксан А2), либо образуются в ходе работы плазменной системы свертывания (тромбин). Важно подчеркнуть еще раз, что эти активаторы действуют исключительно в пределах тромба: быстрый поток за его пределами уносит их, не давая возможности рекрутировать новые клетки в тромб.

Картина роста тромбоцитарного тромба in vivo сейчас достаточно устоялась, и описанная выше последовательность событий считается общепризнанной. Тем не менее в ней хватает неясных мест, которые будут обсуждаться ниже.

Проблемы диагностики функции тромбоцитов

В настоящий момент диагностика функций тромбоцитов не менее чем на 90 % производится с помощью исследования агрегации. Принципы и недостатки этого подхода обсуждались выше; главной проблемой является то, что ни один из тестов агрегации не соответствует тому, что происходит in vivo.

Наверное, еще 10 % функциональной оценки обеспечивается проточной цитометрией, которая позволяет определить антигенный состав белков на поверхности тромбоцита. Наиболее подготовленные специалисты могут также использовать цитометрию для более детальной характеризации функций тромбоцитов: активации интегринов, выхода гранул и фосфатидилсерина. Это дает полезную информацию об отдельных молекулах и способностях клетки. Тем не менее все это не дает ответа на общий вопрос: как адекватно оценить функцию тромбоцитов в целом?

Наиболее естественный ответ: надо заставить тромбоциты формировать тромбы в условиях, приближенных к физиологическим. В настоящее время все большее применение набирают проточные камеры , в которых адгезия тромбоцитов к покрытой коллагеном подложке изучается с помощью микроскопии. В настоящий момент уже существуют коммерчески доступные камеры и ведется их стандартизация, хотя до сколько-нибудь значимого клинического применения в практике диагностического комплекса еще далеко. Возможным соперником для видеомикроскопии являются похожие подходы, использующиеся

У GP Ib-V-IX | GP VI

неакт акт

коллаген

Рис. 6. Основной механизм начального роста тромбоцитарного тромба. Первичное закрепление тромбоцита в месте повреждения происходит путем взаимодействия главного адгезионного рецептора гликопротеина Ш-У-1Х с молекулой-посредником фактором фон Виллебранда (уЩ), закрепленным на обнажившемся коллагене (шаг 1). Затем сигнальный рецептор гликопротеин VI связывается с коллагеном, что ведет к активации тромбоцитов (шаг 2). Активация агрегационныхрецепторов интегринов а2р1 (служит для связывания коллагена) и аШрЗ (для связывания через фибриногеновые мостики с другими тромбоцитами) способствует закреплению активированного тромбоцита на коллагене (шаг 3) и создает основу для дальнейшего роста тромба. Воспроизведено из

в приборах типа РБЛ , где оценивается способность тромбоцитов забивать агрегатами картридж, через который прокачивается цельная кровь.

Проблемы коррекции функции тромбоцитов

Контроль функции тромбоцитов является одним из главных способов борьбы с артериальными тромбозами практически любой природы. Исходно основным препаратом для этой цели был аспирин, блокирующий синтез тромбоксана А2: несмотря на давнюю историю препарата, только во 2-й половине XX века была открыта его способность подавлять тромбообра-зование и снижать риск инфаркта. В 1990-е годы появились эффективные антиагреганты, атакующие рецептор к фибриногену, интегрин аПЪрЗ: абциксимаб, тирофибан, эптифибатид , а также отечественный препарат монафрам. Сейчас оба этих класса препаратов в значительной степени вытесняются ингибиторами аденозиндифосфатного рецептора Р2У12: это в первую очередь клопидогрел, а также прасугрел, тикагрелор и кангрелор . Сейчас активно ведутся работы по созданию новых препаратов, обладающих большей эффективностью и меньшей опасностью кровотечений.

Более сложная задача - как быть, когда тромбоцитов мало или они плохо работают? Технология приготовления и хранения тромбоцитарных концентратов для переливания достигла наилучших результатов к середине 1980-х годов, и принципиальных прорывов с тех пор не произошло. Короткое время жизни, высокий риск иммунных осложнений и инфицирования пациента, непрерывно усугубляющийся во всем мире дефицит доноров, отсутствие вплоть до самого последнего времени искусственных заменителей делают ситуацию с переливанием тромбоцитов крайне неудовлетворительной, возможно, самой проблемной среди всех компонентов крови.

На протяжении все тех же последних десятилетий единственной доступной для клинического использо-

вания альтернативой обычным тромбоконцентратам было криоконсервирование, позволявшее продлить срок их жизни до нескольких лет. Но решить проблему сохранения свойств тромбоцитов при замораживании и размораживании до конца так и не удалось. К тому же замораживание этих клеток оказалось связано с таким количеством технических сложностей, что вплоть до настоящего времени оно не смогло составить успешную конкуренцию использованию незамороженных тромбоконцентратов.

Именно поэтому с каждым годом все большее внимание уделялось начатым еще в 1950-е годы работам по созданию новых препаратов и методов, способных радикально продлить срок жизни и удобство использования донорских тромбоцитов, а то и создать возможные аналоги, позволяющие полностью отказаться от их использования. Антибактериальные препараты и ингибиторы жизнедеятельности тромбоцитов, новые криоконсерванты и протоколы заморозки, лиофилизированные тромбоциты и везикулы на основе тромбоцитарных мембран, эритроциты с гемоста-тической функцией и липосомы - вот далеко не полный список подходов, применявшихся для достижения этой цели. Некоторые из них - например, лиофили-зированные тромбоциты Б1а$1х - уже сейчас находятся в активных клинических исследованиях .

Загадки тромбоцитов

Субпопуляции. Одна из наиболее интригующих загадок тромбоцитов - их гетерогенность. При активации тромбоцитов формируются 2 субпопуляции с драматически разными свойствами . Их формирование управляется не до конца исследованными сигнальными путями . Интересно, что одна из этих субпопуляций ускоряет реакции свертывания, а вторая способна к нормальной агрегации (рис. 7). Это разделение 2 главных функций тромбоцитов интригует , но объяснений ему пока не предложено.

Рис. 7. Субпопуляции тромбоцитов крови радикально различаются по способности к ускорению реакций свертывания и агрегации. Точечные диаграммы суспензии неактивированных (слева) и активированных (справа) тромбоцитов на проточном цитометре. По оси абсцисс отложена флуоресценция аннексина V, маркера фосфатидилсерина. По оси ординат показана флуоресценция фибриногена. Видно, что при активации формируются 2 субпопуляции тромбоцитов, из которых одна на порядки превосходит другую по уровню фосфатидилсерина, но настолько же уступает по связыванию фибриногена. Воспроизведено из

Остановка роста тромба. Выше мы рассмотрели последовательность событий, происходящих в процессе роста тромбоцитарного тромба. Одной из самых больших проблем, которые до сих пор остаются нерешенными, является вопрос об остановке этого роста: почему в каких-то случаях он идет вплоть до полной окклюзии сосуда, а в других сосуд остается свободным? Сейчас существует около десятка гипотез, объясняющих ограниченность размера тромба. Одной из наиболее активно обсуждающихся является предположение о том, что при периодическом разрушении верхней, нестабильной части тромба обнажается сформировавшийся внутри фибрин . Тем не менее этот вопрос еще далек от решения. С большой вероятностью может быть не один механизм остановки, и для разных сосудов эти механизмы могут быть разными.

Тромбоциты и контактный путь. Довольно давно исследователи показали, что тромбоциты потенциально способны активировать свертывание крови по контактному пути . Главными кандидатами на роль активаторов считаются полифосфаты, выходящие из плотных гранул при активации , хотя есть опровержения этой точки зрения . По-видимому, благодаря этой активации контактный путь активации свертывания крови важен для роста тромбоцитарного тромба, как было показано в недавних работах . Это открытие позволяет надеяться на создание новых антитромботических препаратов.

Микровезикулы. Тромбоциты при активации отщепляют липидные микрочастицы, также называемые микровезикулами. Рецепторы на их поверхности сконцентрированы, и поэтому эти частицы обладают колоссальной прокоагулянтной активностью: их поверхность в 50-100 раз более активна, чем поверхность активированных тромбоцитов . Зачем тромбоциты это делают - неясно. Однако в крови даже здоровых людей количество таких везикул значительно, и оно достоверно возрастает у пациентов с различными сердечно-сосудистыми и гематологическими заболеваниями, коррелируя с риском тромбозов. Изучение этих

везикул затруднено их крошечными размерами (30- 300 нм), намного меньше длины волны света .

Тромбоциты в онкологии. Тромбоциты играют двойственную роль при онкологических заболеваниях . С одной стороны, они увеличивают риск и тяжесть венозных тромбозов, характерных для пациентов с опухолями. С другой стороны, они напрямую влияют на течение заболевания, регулируя ангиогенез, рост опухоли и метастазирование с помощью ряда механизмов. Механизмы взаимодействия тромбоцитов с раковыми клетками сложны и плохо изучены, но их исключительная важность сейчас не вызывает сомнения .

Заключение

Тромбоциты крови - важнейшие участники как нормального гемостаза, так и патологического тром-ботического процесса, состояние которых критично для самых разных заболеваний и состояний. В настоящий момент достигнут существенный прогресс на пути к пониманию функционирования тромбоцитов и коррекции тромбоцитарного гемостаза, но количество научных загадок еще очень велико: взаимодействие тромбоцитов с плазменным гемостазом, сложность сигнализации, механизмы регуляции роста и остановки тромбоцитарного тромба. В последнее время появляются сведения о взаимодействии тромбоцитов с другими системами организма, указывающие на их важные роли в иммунитете и морфогенезе. Главными среди практических сложностей являются отсутствие адекватных интегральных тестов функции тромбоцита и затруднительность нормализации этой функции.

Благодарности

Работа авторов поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований 14-04-00670, а также грантами Программ фундаментальных исследований Российской академии наук «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные исследования для разработки биомедицинских технологий».

ЛИТЕРАТУРА

1. Sixma J.J., van den Berg A. The haemostatic plug in haemophilia A:

a morphological study of haemostatic plug formation in bleeding time skin wounds of patients with severe haemophilia A. BrJ Haematol 1984;58(4):741-53.

2. Maxwell M.J., Westein E., Nesbitt W.S.

et al. Identification of a 2-stage platelet aggregation process mediating shear-dependent thrombus formation. Blood 2007;109(2):566-76.

3. Мазуров А.В. Физиология и патология тромбоцитов. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. 480 с.

4. Michelson A.D. Platelets. 3rd ed., 2013. London; Waltham, MA: Academic Press, xliv, 1353 p.

5. Ohlmann P., Eckly A., Freund M. et al. ADP induces partial platelet aggregation without shape change and potentiates collagen-induced aggregation in the absence of Galphaq. Blood 2000;96(6):2134-9.

6. White J.G. Electron microscopy methods for studying platelet structure and function. Methods Mol Biol 2004;272:47-63.

7.van Nispen tot Pannerden H., de Haas F., Geerts W. et al. The platelet interior revisited:

electron tomography reveals tubular alpha-granule subtypes. Blood 2010;116(7):1147-56.

8. Blair P., Flaumenhaft R. Platelet alpha-granules: basic biology and clinical correlates. Blood Rev 2009;23(4):177-89.

9. Abaeva A.A., Canault M., Kotova Y.N. et al. Procoagulant platelets form an alpha-granule protein-covered «cap» on their surface that promotes their attachment

to aggregates. J Biol Chem 2013;288(41):29621-32.

10. Kaplan Z.S., Jackson S.P. The role

of platelets in atherothrombosis. Hematology

Am Soc Hematol Educ Program 2011;2011:51-61.

11. Tanaka K.A., Key N.S., Levy J.H. Blood coagulation: hemostasis and thrombin regulation. Anesth Analg 2009;108(5): 1433-46.

12. Panteleev M.A., Ananyeva N.M., Greco N.J. et al. Two subpopulations

of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex. J Thromb Haemost 2005;3(11):2545-53.

13. Topalov N.N., Kotova Y.N., Vasil"ev S. A., Panteleev M.A. Identification of signal transduction pathways involved in the formation of platelet subpopulations upon activation. Br J Haematol 2012;157(1):105-15.

14. Yakimenko A.O., Verholomova F.Y., Kotova Y.N. et al. Identification of different proaggregatory abilities of activated platelet subpopulations. Biophys J 2012;102(10):2261-9.

15. Kotova Y.N., Ataullakhanov F.I., Panteleev M.A. Formation of coated platelets is regulated by the dense granule secretion of adenosine 5"diphosphate acting via the P2Y12 receptor. J Thromb Haemost 2008;6(9):1603-5.

16. Uijttewaal W.S., Nijhof E.J., Bronkhorst P.J. et al. Near-wall excess of platelets induced by lateral migration of erythrocytes in flowing blood. Am J Physiol 1993;264(4 Pt 2):H1239-44.

17. Tokarev A.A., Butylin A.A., Ataullakhanov F.I. Platelet adhesion from shear blood flow is controlled by near-wall rebounding collisions with erythrocytes. Biophys J 2011;100(4):799-808.

18. Turitto V.T., Weiss H.J. Red blood cells: their dual role in thrombus formation. Science 1980;207(4430):541-3.

19. Nieswandt B., Brakebusch C., Bergmeieret W. et al. Glycoprotein VI but not alpha2beta1 integrin is essential for platelet interaction with collagen. EMBO J 2001;20(9):2120-30.

20. Westein E., de Witt S., Lamers M. et al. Monitoring in vitro thrombus formation with novel microfluidic devices. Platelets 2012;23(7):501-9.

21. Favaloro E.J., Bonar R. External quality assessment/proficiency testing and internal quality control for the PFA-100 and PFA-200: an update. Semin Thromb Hemost 2014;40(2):239-53.

22. Kristensen S.D., Würtz M., Grove E.L. et al., Contemporary use of glycoprotein IIb/IIIa inhibitors. Thromb Haemost 2012;107(2):215-24.

23. Ferri N., Corsini A.,

Bellosta S. Pharmacology of the new P2Y12 receptor inhibitors: insights on pharmacokinetic and pharmacodynamic properties. Drugs 2013;73(15):1681-709.

24. Bode A.P., Fischer T.H. Lyophilized platelets: fifty years in the making. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol 2007;35(1):125-33.

25. Heemskerk J.W., Mattheij N.J., Cosemans J.M. Platelet-based coagulation: different populations, different functions.

J Thromb Haemost 2013;11(1):2-16.

26. Tosenberger A., Ataullakhanov F., Bessonov N. et al. Modelling of thrombus growth in flow with a DPD-PDE method. J Theor Biol 2013;337:30-41.

27. Bäck J., Sanchez J., Elgue G. et al. Activated human platelets induce factor XIIa-mediated contact activation. Biochem Biophys Res Commun 2010;391(1):11-7.

28. Müller F., Mutch N.J., Schenk W.A. et al. Platelet polyphosphates are proinflammatory and procoagulant mediators in vivo. Cell 2009; 139(6):1143-56.

29. Faxälv L., Boknäs N., Ström J.O. et al. Putting polyphosphates to the test: evidence against platelet-induced activation of factor XII. Blood 2013;122(23):3818-24.

30. Hagedorn I., Schmidbauer S., Pleines I. et al. Factor XIIa inhibitor recombinant human albumin Infestin-4 abolishes occlusive arterial thrombus formation without affecting bleeding. Circulation 2010;121(13):1510-7.

31. Sinauridze E.I., Kireev D.A., Popenko N.Y. et al. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost 2007;97(3):425-34.

32. Hargett L.A., Bauer N.N. On the origin of microparticles: From «platelet dust»

to mediators of intercellular communication. Pulm Circ 2013;3(2):329-40.

33. Riedl J., Pabinger I., Ay C. Platelets in cancer and thrombosis. Hamostaseologie 2014;34(1):54-62.

34. Sharma D., Brummel-Ziedins K.E., Bouchard B.A., Holmes C.E. Platelets in tumor progression: a host factor that offers multiple potential targets in the treatment of cancer. J Cell Physiol 2014;229(8):1005-15.