Фенолкарбоновые кислоты действие на организм человека. Растительные фенолы и здоровье человека. Простые фенолы и агликоны фенологликозидов дают

В лекарственных целях используют траву и цветки лабазника вязолистного. В листьях, цветках и корнях лабазника содержат флавоноиды, фитонциды, стероиды, терпены, гликозиды, дубильные вещества, крахмал, эфирное масло, ванилин, и, главное - в большом количестве, витамин С. Трава лабазника вязолистного содержит 0,2 % эфирного масла (компонентами которого являются метилсалицилат и его биозид гаультерин, салициловый альдегид, ванилин), фенольные гликозиды (монотропозид, примверозид, салицин, спиреин), флавоноиды (4 %: авикулярин, гиперозид, спиреозид), дубильные вещества - 15 %, кумарины, стероиды, каротин, витамин С, микроэлементы.

Рассмотрим подробнее действие и свойства химических соединений лабазника вязолистного.

Витамин C. Участвует в биосинтезе кортикостероидных гормонов, которые отвечают за адаптивные реакции организма; повышает иммунитет; устраняет воспаление; стабилизирующее воздействует на соединительную ткань; улучшает психоэмоциональное состояние, поскольку влияет на процесс образования дофамина, норадреналина, а также серотонина и эндорфинов.

Дубильные вещества. Данные вещества осаждают белки протоплазмы, тем самым оказывая на слизистые оболочки либо раздражающее, либо вяжущее действие (все зависит от концентрации раствора). Свойства: вяжущее; кровоостанавливающее; антиоксидантное.

Фенольные соединения (монотропитин, спиреин). Свойства: стимулирующее (активизируют функционирование коры надпочечников); антисептическое; мочегонное; адаптогенное (повышают защитные силы организма); спазмолитическое; седативное; желчегонное; кровоостанавливающее.

Салициловая кислота . Действие: нормализует проницаемость капилляров, тем самым предупреждая отек тканей; участвует в формировании медиаторов воспаления; приостанавливает биосинтез простагландинов, которым отводится важная роль в развитии воспаления, а также болевого синдрома, что снимает воспаление.

Рисунок 5.1 – Салициловая кислота

Флавоноиды : авикулярин. Свойства: противовоспалительное; антиаллергическое; антивирусное; антиканцерогенное; антиоксидантное; желчегонное; противоязвенное; диуретическое; спазмолитическое.

Рисунок 5.2– Авикулярин

Катехины . Данные вещества нейтрализуют свободные радикалы, благодаря чему предупреждают развитие онкологических болезней. Кроме того, катехины противостоят воздействию бактерий и препятствуют разрушению клеток, тем самым значительно замедляя процесс старения организма.

Фенолкарбоновые кислоты. Действие: снимают воспаление; ускоряют процесс выведения желчи; усиливают функцию почек; стимулируют антитоксическую функцию печени.

Эфирные масла. Компоненты: метилсалицилат и салицин. Действие эфирных масел: нормализуют функционирование сердечно-сосудистой системы; смягчают кашель; усиливают отделение слизи из бронхов; улучшают работу ЖКТ. Свойства: бактерицидное; противовоспалительное; антисептическое; стимулирующее; седативное.

Рисунок 5.3 – Метилсалицилат Рисунок 5.4–Салицин

Жирные кислоты . Действие жирных кислот: участвуют в процессе образования энергии; участвуют в построении мембран, которые и составляют скелет клеток; нормализуют обмен веществ, являясь компонентами различных липидов.

Гликозиды. Свойства: мочегонное; противомикробное; успокоительное; слабительное; отхаркивающее; сосудорасширяющее; дезинфицирующее. Крахмал. Используется как обволакивающее средство при лечении заболеваний ЖКТ воспалительного характера. Кроме того, крахмал относится к классу легкоусвояемых углеводов, которые, трансформируясь в глюкозу, быстро насыщают организм энергией.

Рисунок 5.5 – Крахмал

Воск. Обладает бактерицидными и вяжущими свойствами, поэтому применяется при лечении трудно заживающих ран и различных кожных заболеваний.

В 1828 году мюнхенский фармацевт Иоганн Бюхнер выделил из коры ивы противовоспалительное вещество салицин, при гидролизе которого получили салициловую кислоту, а в 1838 году итальянский химик Р. Пириа выделил из таволги (спиреи вязолистной) спиреевую кислоту, оказавшуюся производным салициловой кислоты. Выяснилось, что салициловой кислоты много в таволге иволистной – Spiraea salicifolia, а затем Феликс Хофман, сотрудник германской компании «Байер», разработал технологию органического синтеза ацетилсалициловой кислоты, получившей коммерческое название «аспирин». Это название составлено из двух частей: «а» от ацетил и «спир» от Spiraea. В таволгах аспирин находится в гликозилированной форме. Совсем недавно из семян и корней таволги выделены дитерпеновые алкалоиды, получившие название спираминов и спиратинов. Их действие похоже на камфору, кофеин, но применение не вызывает повышения артериального давления. Как считают ученые, спирамины защищают клетки мозга от кислородного голодания. Из японских таволг выделили вещества, препятствующие образованию тромбов.

Дубильные вещества таволги, подвергаясь окислению, превращаются в вещества с кровавой окраской - флобафены .

В разделе всесторонне рассматриваются закономерности и механизмы биологического действия фенольных соединений - обширной группы органических веществ, повсеместно распространенных в растительном мире. Выполняя наряду с белками, нуклеиновыми кислотами, углеводами и другими соединениями важные функции в растительных клетках и тканях, в составе пищевых продуктов, а также разнообразных лекарственных средств народной и современной медицины поступают в организм человека и оказывают заметное воздействие на работу различных органов.

Рассчитано на врачей, биологов и биохимиков.

Фенолы как лекарственные средства
Знакомство с основными проявлениями физиологической и фармакодинамической активности растительных фенолов убедительно показало, что многие из них имеют большие перспективы использования при лечении и предупреждении болезней человека.

Литература

Основные классы органических соединений: белки, нуклеиновые кислоты, жиры, а также необходимые для жизни минеральные соли и микроэлементы изучаются глубоко и всесторонне. Сотни тысяч страниц кропотливых наблюдений, бесчисленные эксперименты, надежды и разочарования тысяч исследователей, споры и дискуссии, ошибки и открытия - вот что скрыто за лаконичными строками учебников по биохимии.

Белки, состоящие из , водорода, кислорода, азота и серы, действительно выполняют важнейшие жизненные функции. Они образуют вместе с жироподобными веществами (липидами) биологические мембраны - основные структуры, из которых построены клетки. - основные двигатели, катализаторы обмена веществ - важнейшего жизненного процесса. Белки-гормоны - это средства регулирования и управления в машине жизни. Есть в организме белки сократительные, они работают в скелетных мышцах, осуществляют движение ворсинок, продвижение пищевого комка по пищеварительному тракту; белки транспортные, они переносят на поверхности своих огромных молекул многие жизненно важные вещества; белки-антитела - крошечные защитники нашего внутреннего мира от посягательств невидимых врагов - бактерий и вирусов. Нет такой формы жизнедеятельности, такого биологического процесса, в котором белки не играли бы первостепенную роль.

Обнаруженные впервые в составе клеточного ядра, стали известны позже белков, а их назначение в организме установлено в полной мере лишь в последние десятилетия. Оно теснейшим образом связано с ролью белков. Крупные молекулы нуклеиновых кислот (самые большие из них состоят из сотен тысяч и даже миллионов углерода, водорода, кислорода и азота) хранят в своих длинных нитях, в последовательности своих атомных группировок наследственную память клеток, информацию о структуре и производстве белков.

Углеводы и жиры устроены значительно проще, и роль их в организме менее разнообразна. Сгорая в тканях в процессе медленного биологического окисления, они отдают свою энергию на поддержание температуры живого тела, на осуществление процессов биосинтеза нужных ему органических соединений. Жиры и жироподобные вещества входят вместе с белками в состав биологических мембран, на поверхности которых протекают все важнейшие жизненные процессы. Углеводы (они названы так потому, что построены из углерода, водорода и кислорода, причем два последних элемента содержатся в них в том же соотношении, что и в воде, 2:1), особенно крупные молекулы полисахаридов, играют роль энергетического запаса (крахмал, гликоген). Некоторые из них, например , входят в состав оболочки растительных клеток, образуют волокна, служат важным опорным материалом в тканях растений.

Строение и жизненная роль витаминов, само их существование стали известны лишь в XX в. Потребность в них невелика, но они необходимы: при их отсутствии или недостатке человек тяжело заболевает и может даже погибнуть от или пеллагры, бери-бери или . Поступая в организм с пищей, витамины обязательно присутствуют в жидкостях тела неизменными или подвергшись обменной активации. Например, витамин B1 превращается в организме в кокарбоксилазу (дифосфат тиамина), обладающую максимальной активностью.

Водорастворимые витамины В2, В6, РР, Н, фолиевая (Вс) и пантотеновая (В3) кислоты играют в организме роль коферментов. Это своего рода набор стандартных инструментов, с помощью которых ферментные белки выполняют свои каталитические функции: разрезают или соединяют молекулы, переносят группы атомов от молекул одного вещества к другому, ускоряют течение определенных обменных реакций.

Жирорастворимые витамины (A, D, Е, К) входят в состав биологических мембран - основного структурного элемента клеток. Состоят мембраны из двойного слоя липидных (жироподобных) молекул, липидного «моря», в котором «плавают», подобно айсбергам, белковые частицы. Мембраны разделяют клетку на отсеки, выполняющие разные функции; осуществляют перенос молекул, ионов, электрических зарядов, основные реакции обмена веществ. Жирорастворимые витамины стабилизируют структуру мембран, защищают их от окислительного разрушения, обеспечивают нормальную работу мембранных ферментов.

Особняком стоит витамин С; он растворим в жидкостях организма, но коферментной функцией, видимо, не обладает. Как и жирорастворимые витамины, он обладает антиокислительной активностью, но не входит в состав мембран, а в составе биологических жидкостей организма омывает их поверхность.

К середине XX в. пора великих открытий в области изучения химического состава и строения органических веществ, казалось, миновала. Биохимики устремились в погоню за микроэлементами - веществами, присутствующими в живых тканях в исчезающе малых количествах, изучая их роль как кофакторов ферментативного катализа, ускорителей или замедлителей реакций обмена веществ.

Но есть, оказывается, большой и разнообразный класс органических соединений, биологическая роль которых далеко еще не выяснена. Это фенольные соединения. О них-то и пойдет речь в книге.

Их много, этих веществ. Они встречаются в каждом растении, в каждой клетке их тела, в корнях и листьях, в плодах и коре - везде, где их ищут ученые. Из растений выделено несколько тысяч фенолов, и список этот продолжает расти. На долю фенольных соединений приходится до 2-3% массы органического вещества растений, а в некоторых случаях - до 10% и даже более. Конечно, такие распространенные и многочисленные органические вещества должны выполнять какие-то важные, необходимые жизненные функции.

Нельзя сказать, что о роли фенольных соединений растений ничего не известно. Исследования в этой области ведутся более 100 лет, и в последние десятилетия сделано особенно много. Но очень скоро выяснилось странное обстоятельство. Белки и нуклеиновые кислоты, углеводы и липиды содержатся в тканях как растений, так и животных, содержатся примерно в одинаковых или близких соотношениях. Они построены по единому плану, состоят из одних и тех же исходных элементов (аминокислот, нуклеотидов, жирных кислот, моносахаридов). В пищеварительном тракте травоядных растительная пища расщепляется на такие универсальные простые компоненты, входящие в состав собственных органических соединений этих животных, а затем и плотоядных. Причем удается проследить судьбу одних и тех же веществ на протяжении всей биологической цепи, от растений до животных и человека, и функции этих веществ на разных участках цепи у разных видов, классов и типов организмов оказываются примерно одинаковыми и даже аналогичными.

Совершенно иначе обстоит дело с фенольными соединениями. С их обилием и разнообразием в растительном мире резко контрастирует присутствие в тканях животных и человека лишь немногочисленных представителей фенольного «царства», содержащихся к тому же в очень малых, даже ничтожных, количествах. И несмотря на наличие близкого сходства химической структуры растительных и животных фенолов, никому еще не удалось совершенно уверенно и надежно доказать, что между ними существует такая же преемственная связь, как между растительными и животными белками или углеводами. Попытки проследить (с помощью метода меченых атомов или других современных научных методик) за судьбой фенольных соединений растительной пищи в организме животных и человека дали один и тот же результат: основная масса растительных фенолов сгорает в теле животных до и воды, подобно тому как ведут себя углеводы или жиры.

Но является ли роль углеводов чисто энергетической или какая-то их часть все же используется при биосинтезе животных фенолов? Окончательного ответа на этот вопрос еще нет.

Какова же функция растительных фенолов в организме животных и человека, куда они постоянно поступают с пищей? Попытаемся ответить на этот вопрос на страницах раздела.

САЛИЦИЛОВАЯ КИСЛОТА (I) - орто-оксибензойная кислота. Найдена в эфирном масле иланг-иланга, кассии, американского пенниройяля, плодов аниса. В экстракте соцветий спиреи содержится до 60% салициловой кислоты. Ее метиловый эфир (метилсалицилат) широко распространен в природе. Салициловая кислота используется как сырье для получения аспирина и сложных эфиров, которые применяются в парфюмерии, косметике и ароматизации мыл.

Обладает антисептическими свойствами, что используется для консервации фруктовых соков и фармацевтических препаратов.

МЕТИЛСАЛИЦИЛАТ (II) - метиловый эфир салициловой кислоты. Главный компонент (98%) эфирного масла гаултерии (Gaultheria procumbens) и березы (Betula lenta). Находится также в эфирном масле иланг-иланга, руты, гвоздики, цветов кассии и туберозы, зеленого чая. Часто метилсалицилат не является составной частью растения, а входит в состав гликозидов, из которых выделяется при ферментации. Метилсалицилат имеет сильный характерный запах. Обладает бактерицидными свойствами.

Используется как натуральный, так и синтетический для ароматизации жвачной резинки, конфет, различных пищевых продуктов и напитков. Часто входит в состав зубных паст, полосканий и фармацевтических препаратов. Содержится в составе ароматического комплекса различных косметических и парфюмерных препаратов, а также мыл. При передозировке может вызывать повреждение печени и отравление, поэтому применение его ограничено.

ЭТИЛСАЛИЦИЛАТ - встречается редко и в небольшом количестве. Запах характерный, несильный. Используется в ограниченном количестве как синтетический заменитель метилсалицилата.

БЕНЗИЛСАЛИЦИЛАТ - бензиловый эфир салициловой кислоты. Главная составная часть высококипящей части эфирного масла иланг-иланга, бальзама Толу, туберозы. Вязкая жидкость или кристаллы с приятным запахом. Используется как растворитель для искусственных эфирных масел и парфюмерных композиций. Хороший фиксатор.

В эфирных маслах часто встречаются производные простейшей ароматической кислоты - бензойной. Бензойная кислота не имеет запаха и не может влиять на запах эфирных масел. В эфирные масла в результате паровой дистилляции не переходит. Экстрактивные эфирные масла (конкреты и абсолю) могут содержать бензойную кислоту. Ее эфиры являются важными ароматическими компонентами этих эфирных масел. Соответствующей бензойной кислоте альдегид - бензальдегид - нередко встречается в составе некоторых эфирных масел.

Фенолкарбоные кислоты

Фенольная группа фенолкарбоновых кислот может также быть в виде простого эфира. Анисовая кислота - сопутствующий компонент некоторых масел с большим содержанием анетола (о нем мы поговорим в разделе фенилпропенов) - представляет собой метоксибензойную кислоту.

АНИСОВАЯ КИСЛОТА (III) - п-анисовая кислота, п-метоксибензойная кислота. Найдена в эфирных маслах с большим содержанием анетола, которые подверглись действию кислорода. Обнаружена также в эфирном масле из плодов таитянской ванили.

Фенолкарбоновые кислоты могут содержать несколько фенольных групп. Такие вещества 2,4-ДИОКСИ-6-МЕТИЛБЕНЗОАТ (IV) и 2,4-ДИОКСИ-3,6-ДИМЕТИЛБЕНЗОАТ (V), а также 2-МЕТОКСИ-4-ОКСИ-3,6-ДИМЕТИЛБЕНЗОАТ (VI) обнаружены в резиноиде дубового мха и составляют в виде смеси простых фенольных и сложных эфиров подавляющее количество (до 40-50%) фенолов этого продукта.

Среди фенолкарбоновых кислот с несколькими фенольными группами в эфирных маслах содержатся производные верартровой и триметилгалловой кислоты.

ВЕРАТРОВАЯ КИСЛОТА (VII) - 3,4-диметоксибензойная кислота. Встречается в эфирном масле «сабадилла» в виде метилового или этилового эфира.

ТРИМЕТИЛГАЛЛОВАЯ КИСЛОТА (VIII) - 3,4,5-триметоксибензойная кислота. Обнаружена в эфирном масле из Boronia pinnata.

Кроме фенолкарбоновых кислот в эфирных маслах, особенно цветочных растений, содержатся феноло-альдегиды. Почти все вещества этой группы обладают сильным ароматом цветочного направления.

САЛИЦИЛОВЫЙ АЛЬДЕГИД (IX) - о-оксибензальдегид. В небольшом количестве найден в различных видах спиреи, кассии. Имеет характерный горький запах миндаля. Используется в синтетических эфирных маслах. Исходный продукт для получения синтетического кумарина.

4-ОКСИБЕНЗАЛЬДЕГИД (IXa) - п-оксибензальдегид. В эфирных маслах практически не найден.

О-МЕТОКСИБЕНЗАЛЬДЕГИД (IXb) - метилсалициловый альдегид. Содержится в эфирном масле кассии.

АНИСОВЫЙ АЛЬДЕГИД (X) - п-метоксибензальдегид, «обепин». Желтоватая жидкость, обладающая сильным запахом цветущего боярышника с нотой ванилина. Ароматический альдегид, образующийся при окислении анетола, и поэтому встречается в эфирных маслах, богатым анетолом: аниса, звездчатого аниса, фенхеля. Найден также в масле цветов акации, экстракте из бобов ваниллы из Таити. При окислении превращается в анисовую кислоту. Считается очень полезным в парфюмерии для придания композициям (сирень, гелиотроп, боярышник, акация, мимоза, свежескошенное сено и горошек) и мылу особых ароматических свойств.

Феноло-альдегиды

Вторая фенольная группа приводит к появлению среди феноло-альдегидов таких веществ, как ванилин и метилванилин - известные компоненты многих бальзамов.

4-МЕТОКСИСАЛИЦИЛОВЫЙ АЛЬДЕГИД (Xa) - 2-окси-4-метоксибензальдегид, 2-оксианисовый альдегид. Найден в масле из корней Decalepis hamiltonii. Кристаллическое вещество с запахом ванилина.

ВАНИЛИН (XI) - 4-окси-3-метоксибензальдегид - часто встречается в небольшом количестве в эфирных маслах и бальзамах и чаще всего в виде гликозидов (стиракс, бальзам Перу, гвоздика). Под действием ферментов в процессе ферментации эти гликозиды высвобождают ванилин. Наиболее важный источник ванилина - плоды ваниллы. Кристаллическое вещество с сильным, ароматичным запахом.

Главный ингредиент искусственных ароматизаторов. Широко используется в кондитерской промышленности. Применяется в парфюмерии и косметике для придания композициям сладкого и прочного запаха. Хорошо сочетается с гелиотропином и кумарином.

МЕТИЛВАНИЛИН (XII) - 3,4-диметоксибензальдегид, вератральдегид, диметиловый эфир протокатехальдегида. Встречается в эфирном масле Cymbopogon javanensis.

ЭТИЛВАНИЛИН (XIII) - этиловый эфир 3-протокатехальдегида, «бурбональ». В природе не идентифицирован. Синтетический заменитель ванилина. Широко используется в пищевой и парфюмерной промышленности. Имеет интенсивно сладкий вкус и запах в 3-4 раза более сильный, чем ванилин.

СИРЕНЕВЫЙ АЛЬДЕГИД (XIV) - 3,5-диметокси-4-оксибензальдегид. Содержится в выдержанных в дубовой таре (клепке) высококачественных коньяках, виски и бренди. Практически не имеет запаха из-за своей низкой летучести. Образуется при мягком окислении дуба.

Особенностью фенолкарбоновых кислот и феноло-альдегидов является то, что, несмотря на наличие двух «кислых» заместителей их обжигающая функция в сильной степени ослаблена, что объясняется взаимным влиянием этих двух групп (химики говорят об их электронном сопряжении этих групп, в результате которого сильно снижена способность терять водород фенольной группы).

Таким образом, простые фенолы в растениях существуют в виде биологически активных свободных фенолов (тимол и карвакрол), обладающих сильным обжигающим действием, так и в виде простых эфиров (которых содержится очень мало). Простые фенолы, в свою очередь, могут иметь дополнительно различные заместители в бензольном ядре, главные из которых, это альдегидная (CHO) и карбоновая (COOH). Замещение этими группами приводит к ослаблению обжигающего действия простых фенолов из-за эффекта электронного сопряжения этих заместителей и фенольной группы.

Союз Советских

Социалистических

Республик

Государственный комитет

СССР. по делам изобретений и открытий (23) Приоритет

Л.Г.Шакиров, E.Ô.Ñìîëÿíeö, А. 3 .Биккулов, П.М.Зобов и Т.И.Сафонова (72) Авторы изобретения уфимский нефтяной институт (71) Заявитель (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ФЕНОЛКАРБОНОВЫХ

Изобретение относится к органической химии, конкретно к спосо- . бу выделения и очистки фенолкарбоно,вых кислот до высокой степени чистоты. Фенолкарбоновые кислоты находят применение в качестве медицинских агентов, регуляторов роста, а также полупродуктов для синтеза эффективных гербицидов, фунгицидов, пласт. масс, красителей.

Известен способ получения фенол-. карбоновых кислот карбоксилированием гранулированного фенолята щелочного металла при 140-200оC под давлением двуокиси углерода с последующим растворением продуктов реакции в воде, подкислением водного раствора сильной минеральной кислотой и выделением плохо растворимых кислот (13.

Однако этот способ характеризуется невысокой степенью чистоты выделяемых кислот вследствие наличия в продуктах карбоксилирования непревращенных фенолятов щелочных металлов и фенола, образующегося в.качестве побочного продукта реакции.

Для повышения чистоты выделяемого целевого продукта предложены методы очистки фенолкарбоновых кислот, М.

Известен способ, в котором подкисление водного раствора. соли щелочного металла фенолкарбоновых кислот производят в присутствии поверхностноактивного вещества f23.

Однако этот способ,.хотя и позволяет улучшить цветовой показатель целевого продукта, непригоден для выделения фенолкарбоновых кислот высокой степени чистоты из продуктов карбоксилирования фенолятов щелочных металлов, так как не позволяет очистить целевые кислоты от соосаждающихся фенолов.

Известны методы получения фенолкарбоновых кислот карбоксилированием фенолята щелочного металла в среде растворителя либо жидкого разбавителя, позволяющие получать фенолкарбоновые кислоты достаточно высокой степени очистки. Однако эти методы, хотя и облегчают транспортировку сырья и продуктов реакции, сильно усложняют технологию выделения целевого продукта.

Например, предложено проводить процесс карбоксилирования фенолята. калия в среде легких нефтяных.масел. По окончании процесса реакционную массу охлаждают до 150оС и обра1004347 оатывают определенным количеством воды. Водный слой после отстоя отделяют и подвергают экстракции толуолом для извлечения фенола, после чего "подкисляют сильной минеральной кислотой для выделения п-оксибензой,ной кислоты. Нефтяное масло и толуол далее подвергают регенерации для повторного использования f3).

Наиболее близким к пре)слагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ получения фенолкарбоновых кислот карбоксилированием фенолята щелоч.ного металла при 100-180 С, давлении двуокиси углерода до 0,5 МПа и времени реакции обычно 30-90 мин, в среде полярного растворителя с последующим охлаждением, отгонной. растворителя, растворением остатка в воде, нейтрализацией раствора соляной кислотой, экстракцией фенола бензолом и выделением целевого продукта после подкисления раствора до рН 1-3. Целевой продукт имеет чистоту 55,8-98,1% (4).

Недостатками известного способа являются сложная технологическая схема процесса, включающая, помимо узла карбоксилирования фенолятов щелочных металлов, узел регенерации растворителей и экстрагентов, низкая производительность единицы объема реакционного устройства., связанная с проведением процесса в среде растворителей, высокие энергозатраты иа регенерацию: больших количеств высококипящих растворителей вакуумной перегонкой.

Целью изобретения является упрощение процесса и повыаение чистоты получения фенолкарбоновых кислот.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения и очистки фенолкарбоновых кислот, полученных карбоксилированием фенолята щелочного металла при повышенных температуре и давлении двуокиси углерода с последующим охлаждением, обработкой при перемкаивании низшим спиртом или кетоном при соотношении продукт карбоксилирования-спирт или кетон 1:(2-6) соответственно и.выделением целевого продукта подкислением полученной соли минеральной кислотой.

Чистота целевого продукта выше

99%(таблица 1).

Обработка продуктов, полученных карбоксилированием двуокисью углерода сухих фенолятов щелочных металлов, селективными растворителями, растворяющими непрореагировавшее исходное сырье и фенолы, образующиеся в качестве побочных продуктов, и нерастворяющими целевые продукты карбоксилирования - соли щелочных м еталлов фенолкарбоновых кислот, позволяет получить чистые фенолкарбоновые кислоты, а также исключить из технологической схемы пронзводст ва фенолкарбоновых кислот высокой степени чистоты стадии нейтрализации реакционной массы и экстракции фенола.

Пример 1 . 15,0 r продуктов ð реакции, полученных карбоксилированием сухого и-хлорфенолята натрия при 180 С, давлении С02 1,5 МПа и времени реакции 90 мин, содержащих в ебе 12,50 r 5-хлор-2 -оксибензоаа натрия (5х10БНа), 182 г и-хлорфенрлята натрия(п-ХФНа) и 0,33 r п-хлорфенола (п-ХФ) обрабатывают

30,00 r этанола (соотношение зтанол:продукты карбоксилирования =

2:1/ . Полученную суспензию пере20 мешивают в течение 15 мин, после чего центрифугируют для отделения осадка 5-Х-2-ОБНа. Подкислением осадка соляной кислотой выделяют

11,00 г 5-хлор-2-оксибензойной кислоты (5-Х-2-0БК)(98,7% от потенциала) с чистотой 99,9Ъ.

Пример 2 . 15,03 r продуктов карбоксилирования п-ХФНа, полученных в условиях, аналогичных примеру 1, 30 содержащих 12,58 г 5-Х-2-OBNa, 1,83 r п-ХФНа и 0,33 r п-ХФ, обрабатывают

45,09 г этанола (соотношение этанол:продукты карбоксилирования =Зг1).

Осадок 5-X-2 OSNa выделяют анало35 гично примеру 1. Подкислением осадка соляной кислотой выделяют 10,77 г

5-Х-2-ОБК (98,1% потенциала) с чистотой 99,9%.

Пример 2 . 12,33 г продуктов

40 карбоксилирования п-ХФНа, полученных в условиях, аналогичных примеру 1, содержащих 10,33 г 5-Х-2-OBNa,1,50 г п-ХФНа и 0,27 г п-ХФ, обрабатывают

49,33 г этанола (соотношение эта4 нолгпродукты карбоксилирования =4:1).

Осадок 5-X-2-ОБНа выделяют 9,00 г

5-Х-2-ОБК (98,15% от потенциала) с чистотой 99,9%.

Пример 4 ; 7,85 г продуктов карбоксилирования п-ХФНа, полученных в условиях, аналогичных примеру

5,43 r 5-X-2-ОБК (93,2% от потенциала) с чистотой 99,9Ъ.

60 Пример 5 . 12,22 г продуктов карбоксилирования п-ХФНа, полученных в условия, аналогичных примеру 1, содержащих 10,23 г 5-Х-2-OBNa, 1,40 г п-ХФНа и 0,26 r п-ХФ, обрабатывают 48,88 г изопропилового спирт

5 (соотношение изопропиловый спиртгпродукты карбоксилирования = 4:1). Осадок 5-Х-2-OBNa . выделяют аналогично примеру 1. Подкислением осадка азотной кислотой выделяют 9,01 r

5-Х-2-ОБК (99,0% от потенциала) с 5 чистотой 99, 7% .

Пример 6 . 12,24 г продукта карбоксилирования п-Хна, полученных в условиях, аналогичных примеру

1,49 г п-Хна и О, 27-г п-ХФ, обрабатывают 48,96 г ацетона (соотношение ацетон:продукты карбоксилирования = 4:1)..Осадок 5-Х-2-ОБМа выде=, ляют аналогично примеру 1. Подкислением осадка соляной кислотой выделя:, т 9 0? г 5-Х-2-ОБК (99,0% от потениала).с чистотой 99,7%.

Пример 7 . 15,33 r продуктов реакции, полученных карбоксилированием сухого 2,4-дихлорфенолята калия (2-4-ДХФК)при: :190ОС, давлении С02 0,5 МПа и времени реакции

3,5-дихлор-2-оксибензоата калия (3p5-ДХ-2-ОБК), 6,37 г 2,4-ДХФК и

1,00 r 2,4-дихлорфенола (2,4-ДХФ) обрабатывают 45,99 г этанола (соотношение этанол:продукты карбоксилирования = 3:1) . Осадок 3,5-ДХ-2-0БК выделяют аналогично примеру 1. Подкислением осадка соляной кислотой выделяют 6,20 г 3,5-дихлор-2-оксибензойной кислоты (97,3% от потенциала) с чистотой 99,5%.

Пример 8 ..12,32 г продуктов 35 карбоксилирования 2,4-ДХФК, полученных в условиях, аналогичных примеру

Подкислением осадка соляной кислотой выделяют 4,89 г 3,5-дихлор-2-оксибен-45 зойной кислоты(95,6% от потенциала) с чистотой 99,7%.

Пример 9 . 14,86 г продуктов реакции, полученных карбоксилированием о-хлорфенолята калия(о-ХФК) при 180 С, давлении С02 1,0 МПа и времени реакции 150 мин, содержащих в себе 11 21 г 3-хлор-2-оксибензоата калия (3-Х-2-ОБК). 2,75 г ОХФК и 0,64 г о-хлорфенола (ОХФ) обраба.тывают 44,58 r этанола (соотношение этанюл:продукты карбоксилирования =

3:1). Осадок 3-Х-2-ОБК выделяют аналогично примеру 1. Подкислением

"осадка соляной кислотой выделяют

8,98 г 3-хлор-2-оксибензойной кислотой (97,4% от потенциала) с чистотой

Пример 10.. 4,53 г продуктов карбоксилирования о-ХФК, полученных в условиях, аналогичных-.примеру 9, содержащих 3,16 г З-Х-2-ОБК, 0,86 г. о-ХФК и 0,27 г ОХФ обрабатывают

18,12 r этанола (соотнсшение этанол: продукты карбоксилирования = 4 .1).

Осадок 3-Х-2-08K выделяют аналогично примеру 1. Подкислением осадка соляной кислотой выделяют 2,46 г 3-хлор-2-оксибензойной кислоты (94,7% от потенциала) с чистотой 99,7% °

Пример 11 ° «2 80 r продуктов реакции, полученных карбоксилированием сухого и-крезолята натрия при 150ОС, давлении СО 1,0 МПа.и времени реакции 20 мин, содержащих в себе 10,93 г 5-метил-2-оксибензоата натрия (5-М-2-0ББа), 0,63 г й-крезолята натрия (п-KNa).и 1,24 г п-крезола (п-К)обрабатывают 51,20 г танола (соотношение этанол:продукты арбоксилирования и 4:1). Осадок

:5-M-2-0BNà.выделяют аналогично примеру 1. Подкислеиием осадка соляной кислотой выделяют 10,74 r 5-метил-2,-оксилензойной кислоты (5-И-2-ОБК) ,(98,3% от потенциала) с чистотой 99,9%.

Пример 12 . 13,33 г йродуктов карбоксилирования п-KNa, полученных в условиях, аналогичных при- . меру. 11, содержащих 11,39 г 5-М-2-08Na, 0,65 г и-KNa и 1,29 r п-К обрабатывают 53,32 г ацетона (соотношение ацетон продукты карбоксилирования = 4:1) . Осадок 5-М-2-ОБйа выделяют аналогично примеру 11. Подкислением осадка соляной кислотой выделяют 11,16 г 5-М-2-ОБК (98,0% от потенциала) с чистотой 99,9%.

Пример 13 . 12,04 г продуктов карбоксилирования п-KNa, полученных в условиях, аналогичных примеру 11, содержащих 10,28 r 5-М-2-0БИа, 0,59 г п-Кйа, и 1,17 г п-.К обрабатывают

48,16 г изопропилового спирта (соотношение спирт:продукты карбоксилирования = 4:1). Осадок 5-M-2-ОЗИа выцеляют аналогично примеру 11. Подкисяением осадка соляной кислотой выцеляют 10,09 r 5-М-2-OBK (98,15% эт потенциала) с чистотой 99,7%.

Основные преимущества предлагаемого. способа: упрощение процесса производства фенолкарбоновых кислот., высокой степени чистоты на стадии выделения солей целевых кислот за счет обработки продуйтов карбоксилирования щелочных металлов растворителями (спирты, кетоны), позволяющими селективно выделять соли фенолкарбоновых кислот, что позволяет исключить из технологической схемы производства стадии нейтрализации реакционной массы. и экстракции фенола.

Фенолкарбоновая,кислота

Кислотное число экс периментальное

Кислотное число, теоретичес— кое

Чистота кислоты, Ъ

Температура плавления экспериментальная, С

7 3,5-ДХ-2-ОБК 269,6

Примечание: 5-Х-2-ОБК вЂ” 5-хлор-2-оксибензойная. кислота

3, 5-ДХ-2-ОБК вЂ” 3, 5-дихлор-2-оксибензойная кислота;

3-Х-2-ОБК -, 3-хлор-2-оксибензойная кислота

5-M-2-OSK - 5-метил-2-оксибензойная кислота.

Формула изобретения вания при перемешивании обрабатывают,органическим растворителем -. низшйм особ выделения и очистки фе- сййртом. или кетоном при соотношербоновых кислот иэ продуктов, нии 1:(2-6) с последующим раствореeHHEitx карбоксилированием фено- 45 нием очищенного остатка в воде.

Источники информации,принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Великобритании

50,Ð 1101267+ кл. С 2 С, опублик. 1968.

2. Патент Великобритании

1167095, кл. С)2 С, опублик.1969.

3. Патент Франции М 1564997, кл, С 07 С, опублик. 1969.

55 4. Патент Японии Р 43-29943, кл. 2-2355, опублик.1968 прототип) .

Составитель N. Кулиш

Редактор А. Химчук Техред E.Харитончик Корректор E. Рошко

Заказ 1788/29 Тираж 4.16 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

:нолка получ лятов щелочных металлов двуокисью углерода при повышенных давлении и температуре, путем отделения приме.сей органическим растворителем с последующим выделением целевой кислоты из водного раствора очищенного остатка после подкисления минеральной кислотой, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью упрощения процесса и повышения чистоты целе вой кислоты, продукты карбоксилиро325, 2

Похожие патенты:

Изобретение относится к новому способу получения смеси 2-гидроксибензойной кислоты и 4-гидроксибензальдегида или их производных, в частности к способу получения 3-метокси-4-гидроксибензальдегида-ванилина, и 3 этокси-4-гидроксибензальдегида -этилванилина, в котором смесь фенольных соединений, из которых одно соединение (А) содержит формильную или гидроксиметильную группу в положении 2, а другое соединение (В) содержит формильную или гидроксиметильную группу в положении 4, отвечающих общей формуле (IIА) и (IIВ), в которых Y1 и У2, одинаковые или разные, означают одну из следующих групп: группу - СНО; группу - СН2ОН; Z1, Z2, и Z3, одинаковые или разные, означают атом водорода, радикал алкилC1-C4, алкенилС2-С4 или алкоксиC1-C4 линейный или разветвленный, радикал фенил, гидроксил, атом галогена; подвергают селективному окислению, при котором формильная или гидроксиметильная в положении 2 соединения (А) окисляется до карбоксильной группы и, возможно, гидроксиметильная группа соединения (В) в положении 4 окисляется до формильной группы, причем окисление осуществляют в присутствии основания в количестве от 2 - 10 молей на моль фенольных соединений (IIА) и (IIВ), и катализатора на основе палладия и/или платины и получают смесь 2-гидроксибензойной кислоты и 4-гидроксибензальдегида или их производных

Изобретение относится к новым соединениям формулы (I), в которой Ar представляет собой фенил, фуранил, тиофенил, тиазолил, пиридинил; R1 независимо выбирают из группы, состоящей из водорода, низшего алкила, низшего алкокси, галогена и нитро; R2 независимо выбирают из группы, состоящей из водорода и галогена; R4 представляет собой гидрокси или остаток пирролидин-2-карбоновой кислоты, пиперидин-2-карбоновой кислоты или 1-аминоциклопентанкарбоновой кислоты, присоединенных через атом азота аминокислотного остатка; n означает 0, 1, 2, 3, 4 или 5; m означает 0, 1, 2, 3 или 4; р означает 0, и s означает 0, или к их фармацевтически приемлемым солям, при условии, что соединение не представляет собой S-1- пирролидин-2-карбоновую кислоту, 5-(бифенил-4-илоксиметил)фуран-2-карбоновую кислоту, 3-(бифенил-4-илоксиметил)бензойную кислоту, 2-(бифенил-3-илоксиметил)бензойную кислоту, 4-(бифенил-3-илоксиметил)бензойную кислоту, 4-(бифенил-4-илоксиметил)бензойную кислоту, 5-(бифенил-4-илоксиметил)тиофен-2-карбоновую кислоту

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА. СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИТОПАТОЛОГИИ

- : ; - ; : " " ;

На правах рукописи Лидия Владимировна РОЗУМ. ■ ■ 4 .

ФЕНОЛКДРБОНОВЫЕ КИСЛОТЫ РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ ПОРАЖЕНИИ СТЕБЛЕВОЙ РЖАВЧИНОЙ

(06,01.11 -фитопатология и защита растений)

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук ■

МОСКВА -1977

Работа выполнена в лаборатории биохимии и физиологии растений ■ Северо-Кавказского научно-исследовательского института фитопатологии. * -

Научные руководители: доктор биологических нзук^ профессор М. И. Запрометов, кандидат сельскохозяйственных наук В. В. Чигрии.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук^про-, фессор В, И. Кефели, кандидат биологических наук В..В. Ма-

Ведущее учреждение ~ Всесоюзный научно-исследовательский институт защиты растений.

Защита диссертации состоится « 197 г.

в 10 час. на заседании специализированного Совета Всесоюзного научно-исследовательского института фитопатологии,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института. , ""

Ученый секретарь- ;

кандидат сельскохозяйственных

Наук; . ■ ^

Г. В. Пыжнкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время веб большей значение приобретает защита урожая от вредителей и болезней, Одним из вредоносных заболеваний зерновых культур является стеблевая ржавчина пшеницы, вызывающая огромные потери урожая и снижающая товарные качества зерна (Петерсон, 1958; Чумаков и др., 1965). Основной способ борьбы с этим заболеванием - выведение устойчивых сортов. Однако, несмотря на несомненные успехи, одни только селекционные мероприятия не могут привести к радикальному решению этой ^проблемы, поскольку в природе рано или поздно получают распространение биотипы патогена, способные поражать новые сорта. Достигнутые к настоящему времен» успехи в области патофизиологии позволяют считать, что выявление физиолого-биохимических механизмов устойчивости к патогену будет способствовать направленному изысканию эффективных средств защиты растений от ржавчины.

Сведения об изменении фенольного обмена у растений пшеницы при заражении ржавчиной весьма немногочисленны и довольно противоречивы. Анализ литературных данных показывает, что отсутствие единой точки зрения на роль фенольных соединений в латогии"¡¿¿^¿^1 i.аВ.^ТТ%VЛ[сслеД°"

МОПиШ» Li., l. "l t i»V. I 1

ватёлн определяли либо суммарное содержание всех полифенолов в здоровых и зараженных растениях (Kiraly and Farkas, 1962; Seevers and Daly, 1970), либо количество одного какого-то метаболита (El-Naghy, 1963 и др.). Кроме того, эти исследования проведены, как правило, на очень молодых растениях. В природе же реальной угрозе заражения ржавчнной подвергаются более взрослые растения, а с возрастом механизм ответных реакций может существенно изменяться (Чпг-рнн и сотр., 1969; Bateman et al., 1965).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение метаболизма фенол на рбо новых кислот у растений пшеницы при заражении стеблевой ржавчиной. Фенол-карбоновые кислоты представляют собой ключевые метаболиты фенольного обмена и являются предшественниками дело-го ряда ароматических соединений и лигнина (Занрометов, -1964, 197Ü; Тоуэрс,1968). Они обладают высокой физиологической активностью и участвуют в самых различных метаболических процессах, и есть основания думать, что они играют ■важную роль в формировании ^рсакции^верхчувствнтслыю-сти».

В задачи исследования входило:

1) изучение постинфекционных изменений основных фенол карбоновых кислот.пшеницы в начале развития болезни и в момент появления видимых симптомов заболевания;

2) определение активности ферментов, имеющих отношение к накоплению этих фенолкарбоиовых кислот;

3) получение сведений о фунгн- и цитотоксичностн феноль-ных соединений пшеницы, об их физиологических функциях.

Научная новизна, практическая ценность работы и пути реализации. Впервые проведено систематическое исследование обмена фенолкарбоиовых кислот у растений пшеницы при поражении стеблевой ржавчнной. Изучены самые ранние изменения содержания фенолкарбоиовых кислот при заражении, которые имеют непосредственное отношение к некробиозу. Обнаружено, что развитию защитных некрогенных реакций предшествует накопление в тканях устойчивых растений определенных фенолкарбоиовых кислот, обладающих высокой фун-гн- и цитотоксичностью. В отличие от известных работ о роли полифенолов в устойчивости растений пшеницы к инфекционным заболеваниям, наши исследования выполнены на взрослых растениях пшеницы, которые в природе подвергаются реальной угрозе заражения ржавчиной. Результаты экспериментов имеют значение для понимания механизмов защитных реакций растений и могут быть использованы при направленном синтезе новых протнворжавчннных фунгицидов.

Апробация. Материалы диссертации докладывались на И Всесоюзном симпозиуме по-фенольным соединениям (Алма-2

Ата, 1971) и на Ш Всесоюзном симпозиуме по фенольным соединениям (Тбилиси, 1976).

Объем работы. Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав экспериментальной части, заключения, списка цитируемой литературы; включает 12 рисунков и 21 таблицу в тексте. Список использованных литературных источников содержит 230 наименований, из них 131 - на иностранных языках.

В разделе I обзора приведены данные о широком распространении фенольных соединений в растительном мире и перечислены важнейшие функции этих соединений в процессах метаболизма. В разделе II раскрывается важная роль полифенолов в устойчивости растений к грибным, бактериальным и вирусным заболеваниям.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Глава!. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Исследования проводили на двух парах сортов: Капли и Эммер, относящихся к виду ТгШсипт dicoccum, Баллади 116 и Кубанка 3, принадлежащих к виду Triticum durum. Растения выращивали в теплице до фазы выхода в трубку и заражали свежесобранными уредоспорами 40-й расы Puccinia graminis Pers f. sp. tritici Eriks, et Herrn. Первый сорт каждой пары является устойчивым к этой расе ржавчины, второй - восприимчивым. При заражении сорта Баллади 116 отмечен тип реакции 0-0; Капли-0; -1, Эммер и Кубанка 3-3-4 по классификации Гоймана (Гойман Э., 1954). Таким образом, сорта Капли н Баллади 116 представляли несовместимую комбинацию с данным патогеном, сорта Эммер и Кубанка 3 - совместимую.

Образцы зараженных н контрольных (незараженных) растений отбирали в самом начале патогенеза (второй день после заражения) и в репродуктивную фазу развития гриба (пятый день). Целые листья замораживали жидким-азотом, растирали, лиофилизировали, запаивали в ампулах и сохраняли на холоду для проведения анализов.

Растворимые фенольные соединения экстрагировали горячим 80%-ным этанолом. Последний упаривали, водный остаток подкисляли до pH 2,0, и свободные фенолкарбоновые кислоты извлекали диэтиловым эфиром, Глюкозидносвязаниые фе-

нолкарбоновые кислоты определяли после двейадцатичасо-вого гидролиза водного остатка препаратом р-глюкозидазы (0,07"мг/мл) при 37° С и последующей экстракции диэтнловым эфиром. Растворимые этерифицнрованные формы фенолкар-боновых кислот определяли после пятичасового гидролиза (2 и. NaOH в атмосфере азота) водного элюата, оставшегося после обработки раствора р-глюкозндазой. Обесцвеченный растительный материал, оставшийся после извлечения растворимых полифенолов, инкубировали пять часов в атмосфере азота с 2 и, NaOH, и освободившиеся при гидролизе этанол-нерастворимые эфирносвязанные фенолкабоновые кислоты извлекали диэтнловым эфиром после подкисления смеси до рН 2,0, Разделение фенолкарбоновых кислот осуществляли двумерной хроматографией с использованием в первом направлении 1%-ной уксусной кислоты и во втором - органической фазы смеси толуол-уксусная кислота - вода (4:1:5). Хроматограммы обрабатывали слабым раствором соли прочного красного ГГ, фенолкарСюновыс кислоты элюировали из бумаги 0,05 н. "NaOH в этаноле и использовали для количественного определения.

Определение гликозндазной активности проводили на препаратах белка, выделенного из здоровых и зараженных растений, с использованием в качестве "субстратов соответствующих гликозидов л-нитрофенола (Jaynes et al., 1972).

Активность фенилаланин-лммиак лиазы определяли по методу Кукола и Кона (Koufcol and Conn, 1961).

Изучение способности растений пшеницы связывать фе-нольные соединения проводили на примере феруловой кислоты, которую вводили в растения в виде 2-10~3М раствора путем засасывания через срезы листьев. Об интенсивности связывания судили, сравнивая количество кислоты, оставшейся в свободном состоянии, с количеством, обнаруживаемым в гидролизуемых формах через 3 часа после окончания поглощения раствора.

Действие фенольиьгх соединений на прорастающие уредо-споры стеблевой ржавчины изучали в диапазоне концентраций от 10_г М до 2,5 Ю-5 М, При изучении влияния различных фенол>ных соединений на токсичность феруловой кислоты последнюю использовали в концентрациях 2- Ю-3 М и 5 lO-4 М. Другие фенольные соединения добавляли к феруловой кислоте в соотношениях 1:5; 1:2; 2:1; 5:1. Растворы фепольных соединений смешивали с агаром, наносили на предметные стекла и на них напылнвали уредосиоры. Стекла выдёржнва-4

ли 18 часов в темноте при 18-20° С. Подсчет проросших спор проводили в 10 полях зрения микроскопа.

О цитотоксических свойствах феиолкарбоновых кислот судили по распаду хлорофилла в отрезках листьев ■пшеницы, инкубируемых на растворах изучаемых соединений. Определение содержания хлорофилла проводили по методу, описанному Кулаевой (Кулаева, 1973). Кроме этого, цитотоксиче-ские свойства фенольных соединений оценивали по их влиянию на способность тканей листа поглощать из раствора краситель- кислый фуксин; краситель затем элюировали из тканей и колориметрировали при 545 нм.

Для изучения возможности повышения устойчивости растений пшеницы к ржавчине (путем увеличения уровня эндогенных полифенолов) зараженные растения восприимчивого сорта Кубанка 3 трехкратно обрабатывали растворами фенолкарбоновых кислот в концентрации Ю-3 М, На девятый день учитывали количество развившихся пустул на контрольных и обработанных растениях.

Результаты экспериментов подвергали вариационно-ста-тнстпческой обработке с использованием критерия Стьюден-та (Снедекор, 1961) при уровне вероятности Р = 0,95,

Глава II. ПОСТИНФЕКЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ФЕНОЛКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ

И ЛИГНИНА У РАСТЕНИИ ПШЕНИЦЫ ПРИ ЗАРАЖЕНИИ СТЕБЛЕВОЙ РЖАВЧИНОИ

Фенолкарбоновые кислоты (ФКК) растений пшеницы обнаруживаются как в свободном состоянии, так и в составе гликозидов и эфиров как растворимых в этаноле, так и нерастворимых. Суммарное количество всех форм ФКК в листьях пшеницы колебалось в пределах 2228-3259 мкг/г сухого вещества,"Содержание растворимых эфиров составило в среднем 49% от общего количества, нерастворимых - 39%, гликозидов- 9% и свободных ФКК- 3%. Во фракциях свободных, гликозидносвязанных, эфирносвязанных растворимых форм ФКК вами были идентифицированы феруловая, ванилиновая, сиреневая, п-кумаровая, п-оксибензойная кислоты, тогда как во фракции нерастворимых эфиров - только феруловая, ванилиновая и п-кумаровая. Такие кислоты, как феруловая и ванилиновая, имеются во всех фракциях ФКК, почти всегда количественно преобладают н, вероятно, могут считаться одними из основных компонентов фенольного комплекса растений пшеницы.

Заражение пшеницы стеблевой ржавчиной вызывает существенные измеиения в обмене ФКК. Данные таблицы 1

(% к контролю)

Фенолкарбоновые КИСЛОТЫ Несовместимая комбинация Совместимая комбинация

Ка пли Ба.плали 116 Эммер Кубанка 3

Феруловая...... 233* 171* 64* 85

Ванилиновая..... 183* 125 76 10)

Сиреневая...... 126* 117 194* 85

п-Кумароная..... 169* 131* 127 100

п-ОксибешоАиая.... 133 120

* Различия достоверны при Р=0,95.

свидетельствуют о том, что устойчивые сорта характеризуются накоплением свободных феполкарбоновых кислот в отличие от восприимчивых сортов, которые не обладают этой способностью. У устойчивого сорта Капли, дающего типичную реакцию «сверхчувствительности», в начале развития некробиоза достоверно возросло содержание всех ФКК. Содержание наиболее токсичной для ■патогена феруловой кислоты в этом случае возрастает более чем в два раза. У сорта Баллади 116, реакция которого ближе к иммунной, также обнаружено увеличение всех фенол кар бонов ых кислот. Накапливаются ванилиновая и сиреневая кислоты, которые могут усиливать токсическое действие феруловой кислоты. У восприимчивых же сортов заражение ржавчиной, как правило, не сопровождалось накоплением свободных феполкарбоновых кислот. Более того, в тканях сортов Эммер и Кубанка содержание феруловой кислоты даже снижалось, количество других ФКК тоже уменьшалось или оставалось на уровне контроля. Отмеченные изменения сохранялись и на пятый день после заражения, однако они выражены не так отчетливо, и, по-видимому, менее важны с точки зрения выяснения факторов некробиоза.

Во фракции гликозидов заражение не вызвало существенных изменений, хотя определенная тенденция к снижению их уровня может быть отмечена к пятому дню после инокуляции, особенно у устойчивых сортов. Значительные изменения наблюдались во фракциях растворимых и нерастворимых эфи-ров. Как показывают данные таблицы 2, содержание этанол-растворимых эфиров ФКК резко уменьшилось уже на второй день после заражения. Это уменьшение особенно значительно у устойчивого сорта Капли, для которого характерна б

Фе і і олка р бон овые кислоты Несовместимая комбинация Совместимая комбинация

Капли Баллади 116 Эммер Куба яка 3

дни после заражения.

2 5 2 5 2 5 2 i-

Феруловая...... 37* 36* 91* 90* 68* 70* 99 98

Ванилиновая..... зо* 36* 64* 78* 37* 79 115 98

Сиреневая...... 10* 38* 79* 77* 36* 108 89 96

и-Кумаровая..... 28* 10* 102 87 33* 66* 69* 88

л-Оксибснзойлая. . . . 97 73* Ш 114

* Различия достоверны при Р=0,95,

обширная иекротизация в местах внедрения патогена. Снизилось содержание феруловон, ванилиновой, сиреневой кислот и у устойчивого сорта Баллад» 116. У восприимчивого сорта Эммер заражение также способствует уменьшению эфирно-связанных этаиолрастворнмых ФКК, однако эти изменения [¡ыражены менее отчетливо, У высоковосприимчнвого сорта Кубанка 3 количество растворимых эфиров практически пе изменяется под действием заражения. "

Достаточно четкие различия между устойчивыми и восприимчивыми сортами обнаруживаются во фракции нерастворимых эфиров, ассоциированных с материалом клеточных стенок (таблица 3). Устойчивые сорта реагируют на заражение резким снижением содержания эфнрносвязанной феруловой кислоты. Этот факт может свидетельствовать о том, что какие-то реакции метаболизма этой кислоты играют важную роль в процессе патогенеза. Количество ванилиновой и п-кумаровой кислот также обнаруживает тенденцию к уменьшению у устойчивых растений в начале развития болезни. В противоположность этому у восприимчивых растении инфекция, как правило, не вызывает снижения содержания нерастворимых форм ФКК, а в некоторых случаях можно даже наблюдать заметное увеличение их.

Данные о количественных изменениях различных форм ФКК свидетельствуют о том, что заражение по-разному влияет на фенольный обмен устойчивых и восприимчивых растений пшеницы. Так, устойчивым сортам свойственно значительное накопление свободных ФКК, которые обладают высо-

Фе її ол к а р боно в ые кислоты Несовместимая комбинация Совместимая комбинация

Капли Баллади 11 б Эммер Кубанка 3

дни после заражения

Феруловая 36* 25"" 27* 36* 98 128* 80 152*

Ванилиновая 74* 115 85 103 167* 99 166* 127*

п-Кумаровая 83* ПЗ 75 101 І 83* 90 26* 124

* Различия с контролем достоверны при Р=0,95.

кой физиологической активностью (Бардинская и др., 1962; Кйс et al„ 1956), н довольно глубокие изменения во фракции связанных форм фенольных соединений. В противоположность этому у восприимчивых сортов некоторые изменения претерпевает лишь количество растворимых в этаноле форм ФКК. В то же время нерастворимые в этаноле ФКК не подвергаются заметным воздействиям.

Представлялось вероятным, что накопление свободных ФКК может происходить вследствие: а) повышения активности гидролитических ферментов, среди которых наиболее интересны гликозндазы, способные гидролизовать не только глико-эиды, но и некоторые эфиры (Тоуэрс, 1968); б) усиления биосинтеза ФКК de novo и в) подавления процессов связывания их в виде гликозидов, эфиров и лигнина {Тоуэрс, 1968). Результаты определения гликозидазной активности, представленные в таблице 4, показывают, что у иммунного сорта Балла-дн 116 активизируются как р-, так и а-гликозидазы; у устойчивого сорта Капли, образующего обширные некрозы, активизируются только р-гликозидазы. Гликозидазная активность восприимчивых растений, как правило, снижается или остается на уровне контроля.

Изучение активности фенил ал анин-аммиак лиазы (НФ 4.3.1.5) - (ФАЛ-лиазы), которая играет чрезвычайно важную роль в биосинтезе фенольных соединений, показало, что у устойчивого сорта заражение приводит к существенному увеличению активности этого фермента (рис. 1). У восприимчивого сорта наблюдали незначительное"повышение активности ФАЛ-лиазы или даже снижение ее активности по сравнению с контролем, особенно в начальной стадии развития инфекции.

дни после жтт

Рис. І Акпмості фшлшдон - шш яшм ь тщтшш литих дошцм.

Определение интенсивности связывания экзогенной феру-ловой кислоты показало, что в начале патогенеза в тканях не-зараженных листьев сорта Капли за 3 часа 98% этого соединения превращалось в связанные формы, тогда как в зараженных листьях - только 95%. У сорта Эммер интенсивность связывания при заражении возросла с 93 до 98%. Хотя эти различия невелики, они статистически достоверны и свидетельствуют об ослаблении процессов связывания фенолкарбо-новых кислот при заражении устойчивого сорта и усилении - у восприимчивого.

Таблица 4

Активность гликозидаз (мгк субстрата/м{Гбелка/час) в листьях Пшеницы (через два дня после заражения стеблевой ржавчмной)

Глнкозидазы Несовместимая комбинация Совместимая комбинация

Капли Балладн 116 Эммер Кубанка 3

здоров ые зараженные здоровые зараженные здоровые зараженные здоровые зараженные

Р-глюкоз ида за 338 389 75)Е>9 508 387 595 496

а-глюкоз и да за 6 6 0 7 10 5 7 8

р-галактозидаза 165 183 46 130 273 226 101 102

а-галактозид аз а 89 85 39 99 51 37 46 31

устойчивому (Капли) сортам, позволяет предполагать, что в первом случае успех защитной реакции связан не столько с количеством высвободившихся ФКК, сколько с быстротой осуществления этого процесса, обусловленной резким активированием р- и а-гликозидаз. Таким образом, накопление свободных ФКК в листьях устойчивого сорта может быть связано с усилением гликозидазной активности тканей листа, активированием ФАЛ-лиазы и ослаблением процессов связывания свободных кислот.

Как указывалось выше, доля растворимых и нерастворимых эфиров ФКК составляет в сумме 88% всего количества ФКК пшеницы, тогда как на долю свободных приходится 3%. " Очевидно, что постинфекционную убыль эфиров ФКК (табл. 2 и 3) никак нельзя объяснить только усилением их гидролиза, с которым частично может быть связано накопление свободных ФКК в листьях устойчивых растении (табл. 1). Возникает вопрос о возможных причинах столь резкой убыли эте-рифицированных ФКК, особенно заметной в листьях устойчивых растений. Одной из таких "причин является, вероятно, интенсификация дыхания зараженных растений (особенно устойчивых) и связанная с этим большая потеря углерода в виде СОг. Изучение этого вопроса показало, что на 2:й день. после заражения у сортов Капли и Эммер выделение С02 листьями увеличилось на 54% и 45% соответственно. Резкое усиление потерь углерода вполне могло снизить объем биосинтеза вторичных соединений (в том числе лигннна) в связи с необходимостью поддержать на оптимальном уровне концентрации биологически более важных метаболитов.

Другой причиной убыли эфиров ФКК в листьях может быть перераспределение фенолкарбоновых кислот между надземными органами и корнями. Одним из подтверждений обоснованности этого предположения служит тот факт, что в корнях растений устойчивого сорта Капли в начале заболевания количество свободных ФКК при заражении возросло на 43%, связанных (растворимых и нерастворимых)-на 78% и общее количество - на 75%. У сорта Эммер заметно (на 58%) увеличилось только содержание первой фракции. Общее количество ФКК, в том числе связанных форм, возросло незначительно (на 10% и 7% соответственно). Таким образом, сопоставляя данные таблиц 2 и 3 с результатами определения ФКК в корнях, можно предположить, что накопление фенолкарбоновых кислот в этих органах в известной мере коррелирует с убылью связанных форм ФКК в листьях. Полученных данных недостаточно, чтобы датъ завершенную интерпретацию взаимосвязи фенольного обмена надземных органов и корневой системы. Возможно, что убыль эфиров ФКК в зараженных листьях связана с тем, что заражение способно вызвать изменения метаболизма в органах, отдерфных от места развития патогена (Рац|есЬ, 1974), и усиление биосинтеза ФКК в корнях ведет к «перехвату» каких-то предшественников, которые в норме направляются из корней в листья. Нельзя, по-видимому, исключить и возможность оттока непосредственно растворимых ФКК из листьев в корни. Проведенный нами эксперимент показал, что при погружении корней пшеницы в растворы 4-метнлумбеллиферо-]0

конртмр M

я<г* uf* w* mi* b"ti3 /гг

Фмомя -кислота-"

Ii "шаровая кислота

".........- бшиновая кислота

Puc. з Токсичность фенолклрбоно&ых кислот

№ КЛЕТОК МСТЕННй ПШЕЩЫ.

на н п-оксибензойной кислоты эти вещества накапливались в листьях и стеблях.

Таким образом, резкая убыль эфиров ФКК в зараженных листьях устойчивых сортов может быть связана, с одной стороны, с патологически возросшей интенсивностью дыхания и, с другой - с усилением биосинтеза ФКК в корнях.

Глава III. ИЗУЧЕНИЕ ФУНГИ- И ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИИ

Наибольшей токсичностью для прорастающих уредослор гриба обладают феруловая кислота и кониферилозый спирт, которые даже в концентрации 5* Ю-" М подавляли прорастание спор на 44% и 38% соответственно. Другие фенольные соединения, встречающиеся в растительной клетке, могут оказывать разнообразное действие на токсичность количественно преобладающей феруловой кислоты. Действительно, данные, представленные в таблице 5, позволяют отметить, что.

Таблица 5

Токсичность фенольных соединений и их смесей для прорастающих у ре д оспор стеблевой ржавчины пшеницы

Соединениє % подавления прорастакня уредослор под влиянием

веществ в концентрации 5 ■ КММ вещее ти (М) в смесіг с феруловой кислотой 5- Ю-"1 М

2,5 > І0-г (5:1) 10-" (2:1) 5- 10"* (1: 1) 10-" (1:5)

Феруловая кислота. . . 44

Конифсрнловьій спирт 33 77* 74* 76* 50

Ваннлил....... 0 100* 71* _ 67*

Ванилиновая кислота. . 0 95* 75* 55* 27*

Сиреневая кислота. . 0 60* 45 49 59

Протокатеховая кислота 0 - 19* 16* 13*

Кверцетин...... 50 29 15* 28 32

* Различил между данным вариантом и чистої! феруловой кислотой достоверны при Р = 0,95.

например, коннфериловый спирт проявил аддитивность по отношению к феруловой кислоте. При добавлении других соединений,"главным образом, имеющих в бензольном кольце 4-окси, 3-метокси или 4-окси, 3,5-ди-метокси групировкн (ванилиновая н сиреневая кислоты, ванилин) отмечается определенный синергизм с феруловой кислотой. В то же время ПОлифенолы с 3,4-диокси- группировками (протокатеховая кислота, кверцетин) проявили антагонизм. Таким образом,

характер токсического действия фенольного комплекса.весьма сложен: он определяется не только концентрацией наиболее токсичных веществ, но и их соотношением с веществами, способными усиливать или ослаблять их действие.

В связи с тем, что фенольные соединения, как выяснилось, обладают довольно высокой фунгитокснчпостью, представлялось важным изучение возможности повышения устойчивости растений пшеницы путем непосредственного введения в ткани листа отдельных фенолкарбоновых кислот и их смесей.

Приведенные в таблице 6 данные позволяют отметить, что обработка листьев восприимчивого сорта растворами ФКК приводит к снижению не только степени поражения, но и одновременному изменению типа поражения растений. Так, если в контрольном варианте тип "поражения составил 3-4 балла, то в варианте с участием феруловой кислоты, и особенно ее смесей с ванилиновой и сиреневой кислотами, тип поражения приближался к 1. Данные таблицы 6 хорошо согласуются с представлением о том, что постинфекционное возрастание концентрации ФКК в листьях может быть одним из факторов, ответственных за несовместимость партнеров.

Фенольные соединения, накапливаясь в зоне внедрения патогена, могут, по-видимому, проявлять также и цитотокси-ческое действие. Поскольку первым очевидным симптомом реакции «сверхчувствительности» является распад хлорофил-

* Таблица 6

Изменение реакции растений пшеницы на заражение стеблевой ржавчиной под влиянием их обработки Ю-3 М растворами феиолкзрбоновных кислот

Интенсивность

Варианты опыта заражения Тип

число % к контролю реакции

пустул на лист *

Контроль (вода)....... 16 100 3-4

Феруловая кислота...... 10 63 1-2

Ванилиновая кислота.... 9 56 1-2

Сиреневая кислота...... II 69 2

Протокатеховая кислота, . . 13 81 3

п-кумаровая кислота..... . 13 81 2-3

п-оксибензойная кислота.... 1! 69 2-3

Феруловая+протокатеховая кисло-

ты............ 13 81 .2

Феруловая+ ваиилинова ясирене- 43

вая кислоты........ 7 1

Феруловая+ванили новая+- сирене- 56 1

ва я+протокатеховая кислоты 9

* Наименьшее существенное различие при Р=0,95 равно 3.

^__о о*-- 1 40

ли до"* ">"s w3 »w"»

»- Лол деіістши ферулово» кщштм.

*-- пои^сшен продуктаее"ошеіш.

Рис. Штті фершміі кислоти h продукта ft окисления

ла в зоне инфекции и связанное с $тим образование хлоро-тичного пятна, можно было полагать, что изменение количества хлорофилла в отрезках листьев, инкубированных на растворах ФКК, служит мерой токсичности полнфенолов для растительных клеток. Проведенное нами изучение цитотоксич-ности фенолкарбоновых кислот показало, что феруловая и сиреневая кислоты в концентрациях 4-Ю"3 М и 6-10~3 М вызывали разрушение хлорофилла в отрезках, "помещенных на растворы этих кислот, В других опытах о цитотоксическом действии ФКК судили по способности обработанных ими растительных тканей поглощать из раствора краситель - кислый фуксин. В качестве эталона токсичности был использован гербицид паракват с отчетливо выраженным некроген-ным действием по отношению к растительным тканям. Глюкоза и хлористый натрий были выбраны как заведомо нетоксичные вещества (в использованных нами концентрациях). Приведенные на рисунке 3 данные позволяют сделать вывод о том, что фенолкарбоновые кислоты проявили цитотокснче-ский эффект и в этом отношении они образовали следующий ряд: феруловая>п-кумаровая>ванилиновая.

Однако в растениях ¡n vivo фенольные соединения могут оказаться еще более токсичными. Известно, что под действием фенолокисляющих ферментов полифенолы переходят в хиноны (Стом, 1972, 1973), которые по токсичности значительно превосходят исходные фенольные соединения (Стом, 1970). Нами было изучено влияние продукта окисления фе-руловой кислоты (трансформация последней осуществлялась "пероксидазой из хрена 30 мин. в присутствии НгОг) на отрез! ки листьев пшеницы. Данные, .представленные на рисунке 4, позволяют полагать, что продукт окисления феруловой кислоты обладал более высокой цитотоксичностью по сравнению; с исходной формой этого соединения.

Таким образом, фенолкарбоновые кислоты, а также, ве-¡ роятно, и продукты их окисления, могут проявлять токсичность как для патогена, так и для самой растительной клетки.

Заключение

Нами установлено, что уже в самом начале развития возбудителя стеблевой ржавчины в тканях устойчивых растений t пшеницы возрастает активность глюкозидаз и фенилаланин-аммиак лиазы, интенсивность же связывания фенолкарбоновых кислот в виде растворимых, нерастворимых эфиров и лигнина, наоборот, снижается. Это приводит к накоплению в зараженных листьях свободных фенолкарбоновых кислот, среди которых преобладает феруловая кислота, отличающаяся заметной фунги- и цитотоксичностью.

Это накопление," конечно, происходит локально в местах контакта патогена с листьями растения, и это локальное повышение концентрации является, по всей вероятности, гораздо более значительным, чем то, которое мы обнаружили при, анализе листа в целом. Косвенным подтверждением того, что наблюдавшиеся нами изменения в фенольном комплексе листьев ассоциированы с зонами контактов, является тот факт, что развитию обширных некрозов на листьях сорта Капли предшествовало более сильное повышение концентрации свободных ФКК, чем в случае иммунного сорта Баллади 116 с его точечными некрозами.

При контакте с пероксидазной системой может иметь место образование окисленных продуктов, отличающихся более высокой фунги- и цитотоксичностью, чем исходные соединения. Такой контакт может осуществляться вследствие постинфекционных нарушений внутриклеточной компартменталнза-цин (Метлицкий, Озерцковская, 1968). Во всяком случае, несомненно, что при заражении устойчивых растений пшеницы стеблевой ржавчиной интенсивность пероксидазного окисления фенольных соединений резко возрастает (Чигрип и др., 1969).

Подтверждением наших предположений о защитных функциях фенолкарбоновых кислот являются также результаты экспериментов, в которых восприимчивые растения обрабатывали растворами этих соединений. Мы, естественно, далеки от того, чтобы связывать развитие совместимой или несовместимой реакции на заражение исключительно с особенностями изменения концентраций тех или иных фенолкарбоновых кислот. Тем не менее полученные в нашей работе данные свидетельствуют о том, что определенная связь между ранними постинокуляционными изменениями фенольного комплекса и характером реакций на заражение стеблевой-ржавчиной все же имеется.

Результаты изучения особенностей фенольного метаболизма у растений пшеницы с различной устойчивостью к стеблевой ржавчине, проведенные в 1968-1973 гг., позволяют сделать следующие основные выводы.

1. Фенолкарбоновые кислоты листьев пшеницы присутствуют главным образом в виде этанолрастворимых и этанол-нерастворимых эфиров, а также в виде гликозидов и в свободном состоянии. Общее количество всех этих форм составляет 2,2-3,2 мг/г сухого вещества. Из этого количества на долю нерастворимых и растворимых эфиров, гликозидов и свободных кислот приходится в среднем 39%, 49%. 9% и 3% и

соответственно. В последних трех фракциях обнаружены феруловая, ванилиновая, сиреневая, п-кумаровая и п-оксибен-зойная кислоты, в этанолнерастворимой-феруловая, ванилиновая и п-кумаровая,

2. При заражении устойчивых растений стеблевой ржавчиной уже в начале патогенеза (2-й день после инокуляции) заметно возрастает активность гликозидаз и фенилаланин-аммиак лиазы при одновременном снижении способности тканей листа переводить свободные фенолкарбоновые кислоты в связанное состояние. Эти изменения приводят к резкому увеличению содержания свободных фенолкарбоновых кислот, в особенности феруловой кислоты, У восприимчивых растений подобных изменений не выявлено, некоторое возрастание содержания фенолкарбоновых кислот наблюдается к 5-му дню после заражения.

3. Заражение устойчивых растений сопровождается уменьшением содержания связанных фенолкарбоновых кислот н лигнина в листьях. С другой стороны, у восприимчивых растений снижается содержание лишь растворимых фенольных соединений, а количество нерастворимых эфиров фенолкарбоновых кислот даже несколько возрастает,

4. Инфицирование растений пшеницы уредоспорами стеблевой ржавчиЕШ сказывается также на фенольном обмене корней. При этом происходящие в корнях изменения противоположны тем, которые характерны для зараженных листьев: содержаниецсвободных фенолкарбоновых кислот и их нерастворимых эфиров здесь существенно возрастает. Указанные процессы более ярко выражены в устойчивых растениях, нежели в восприимчивых.

5. Установлена высокая токсичность феруловой кислоты для прорастающих уредоспор патогена. Ванилиновая и сиреневая кислоты, будучи нетоксичными для уредоспор, при совместном применении с феруловой кислотой достоверно усиливал]! токсическое действие последней. Феруловая кислота оказалась также наиболее токсичной для тканей листьев пшеницы, причем окисление ее в течение 30 мин. "пероксндазой повышало цнтотокснчность (способ образования еще более токсичного продукта),

6. Обработка зараженных восприимчивых растений раствором феруловой кислоты и особенно ее смесью с ванилиновой и сиреневой не только достоверно снижала интенсивность заражения, но изменяла и тип реакции, приближая его к типу, характерному для устойчивых растений. Полученные данные позволяют считать, что локальное накопление фенолкарбоновых кислот в зоне развития патогена может быть одной из причин некротизации клеток н гибели патогена в тканях устойчивых растений.

1. Изменения фенольного обмена у яровой пшеницы при заражении стеблевой ржавчиной. Физиология растений, 1969 (16), 2, 330-335 (в соавторстве с В. В. Чигриным).

2. Токсичность фенольных соединений для прорастающих уредоспор стеблевой ржавчины пшеницы Puccinia graminis Pers f. sp. tritici Eriks, et Henn. Микология и фитопатология, 1969, 3 (3), 243-248 (в соавторстве с В. В. Чигриным и Л. М. Бессмельцевой).

3. Некоторые особенности фенольного обмена у сортов пшеницы с различной устойчивостью к стеблевой ржавчине. Тезисы Второго Всесоюзного симпозиума по фенольным соединениям. Алма-Ата, 1970, 106 (в соавторстве с В. В. Чигриным).

4. Фенолкарбоновые кислоты и лигнин в листьях устойчивых и восприимчивых сортов яровой пшеницы при заражении стеблевой ржавчиной. Физиология растеннй, 1973, 20, вьш, 5, 942-948 (в соавторстве с В. В, Чигриным, Н. М. За-прометовым).

5. Некоторые особенности фенольного обмена пшеницы и устойчивость к стеблевой ржавчине. Тезисы Третьего Всесоюзного симпозиума по фенольным соединениям. Тбилиси, 1976 (в соавторстве с В. В. Чигриным, М, Н. Запрометовым).

Л 77690 1/1V-77 г. Объем ] п. л. Заказ 745.

Типография Московской с.-х. академии им. К- А. Тимирязева 125008, Москва А-8, Тимирязевская ул., 44